Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi di ricerca delle neuroscienze e della medicina orale tradizionale sugli screening per i composti naturali neuroprotettivi rilevanti per il Modello. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la maggiore producibilità del volume dell'infezione è in conformità con la dose di temporizzazione ischemica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è tipico inserire un attrezzo molto sottile nell'arteria cerebellare originale e centrale utilizzando un microscopio sterile.
A dimostrare la procedura sarà Se-Eun Lee, uno studente di scuola che studia nel mio laboratorio. Per preparare l'estratto di Glycyrrhizae Radix et Rhizome, o GRex, aggiungere prima 200 grammi di Glycyrrhizae Radix et Rhizome, o GR, a due litri di metanolo per un'incubazione di cinque giorni a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, filtrare la soluzione attraverso carta filtrante spessa 0,26 millimetri con una dimensione dei pori di cinque micrometri.
Aggiungere il residuo GR a un litro di metanolo fresco e filtrare nuovamente la soluzione. Unire i due filtrati e filtrarli attraverso un nuovo pezzo di carta da filtro. Quindi concentrare l'estratto sotto vuoto prima della liofilizzazione per produrre GRex.
Per preparare il GRex per la somministrazione, sciogliere il prodotto liofilizzato in dimetilsolfuro e diluire la miscela con soluzione salina fisiologica allo 0,9%. Quindi filtrare la soluzione attraverso un filtro siringa da 0,45 micrometri, e regolare la concentrazione finale di DMSO a meno del 5%Per impostare un modello di occlusione dell'arteria cerebrale centrale del mouse, o MCAO, confermare la mancanza di risposta allo stimolo della coda in un topo C57BL/6 maschio da 22 a 25 grammi anestetizzato di sei settimane e posizionare il mouse su una coperta di tenuta della temperatura corporea di 36,5 gradi Celsius, collegata a un termometro. Dopo aver rimosso tutti i capelli dal petto e dal collo del mouse rasando e depilatoriando la crema, posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio e fare un'incisione cutanea di due centimetri al centro del collo.
Isolare con cura l'arteria carotide comune sinistra, l'arteria carotide esterna e il ramo dell'arteria carotide interna dai tessuti connettivi circostanti, e utilizzare una sutura di seta 4.0 per legare l'arteria carotide esterna e la comune arteria carotide con un nodo mezzo intoppo per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria carotide interna. Inserire una sutura da 0,1 a 0,12 millimetri di spessore di 11 millimetri di lunghezza rivestita in silicone 8.0-monofilamento 4.0-seta attraverso l'arteria carotide interna all'origine dell'arteria cerebrale centrale sinistra e utilizzare un misuratore di flusso Doppler laser per misurare la diminuzione dell'arteria relativa del flusso sanguigno cerebrale. Fissare il filamento inserito al vaso sanguigno per due ore mentre l'arteria cerebrale è occlusa.
Alla fine del periodo di occlusione, ritirare attentamente il filamento per ripristinare il flusso sanguigno per 22 ore di riperfusione. E usa suture da 3,0 sete per suturare la pelle in cinque punti con due nodi a metà intoppi. Quindi riportare il topo nella sua gabbia per il recupero anestetico.
Un'ora dopo la fine della riperfusione, somministrare 300 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo GRex agli animali da esperimento, solo per gavage orale. 24 ore dopo l'inizio dell'MCAO, fare un'incisione nella pelle centrale della testa di ogni animale sperimentale e rompere le ossa parietali con forcette angolate, mentre si stacca la dura madre. Isolare con cura il cervello dal cranio, e usare una matrice cerebrale del topo per tagliare il tessuto asportato in sezioni spesse un millimetro.
Macchiare le sezioni per 17 minuti in soluzione 2%TTC, secondo protocolli standard. E fissare le sezioni in formalina al 10% per almeno 2 ore prima di immagini dei campioni con una fotocamera digitale. Quindi analizzare e quantificare l'area dell'infarto cerebrale di ogni sezione utilizzando ImageJ.
Nel punto di tempo sperimentale appropriato dopo l'MCAO, perfondere ogni animale sperimentale eutanasiato in modo transcardiale con 10 millilitri di PBS, seguito da 10 millilitri di paraformaldeide al 4%. Dopo aver isolato il cervello come appena dimostrato, immergere gli organi raccolti in 10 millilitri di 30% di saccarosio durante la notte. La mattina seguente, incorporare i campioni di tessuto cerebrale in un composto ottimale della temperatura di taglio.
E affettare i tessuti coronally in sezioni spesse 15 micrometri su un cirostato. Montare le sezioni su vetrini e immergere le sezioni in 80%etanolo per 1 minuto. Per la colorazione H&E, etichettare i campioni con soluzione di ematossilina per 5 minuti, seguiti da due tuffo nell'alcol acido all'1%.
Successivamente, immergere gli scivoli in soluzione di carbonato di litio saturo per 30 secondi, seguito da un lavaggio di 30 secondi in acqua del rubinetto e 30 secondi di contro-colorazione con la soluzione Eosin. Rimuovere la soluzione di Eosin in eccesso con un lavaggio dell'acqua del rubinetto e disidratare le diapositive con immersioni ascendenti di un minuto in 95, quindi etanolo al 100%. Quindi, ariedire gli scivoli, cancellarli in xilene per almeno 10 minuti e montare i copripavimenti con mezzo di montaggio.
Per la colorazione viola cresile, posizionare le diapositive trattate con etanolo all'80% su uno scaldascivolo per almeno un'ora, seguite da immersione nel 50% di etanolo diluito con cloroformio durante la notte. La mattina seguente, macchiare gli scivoli con 0,1% di viola cresile per 10 minuti in un forno secco Celsius di 40 gradi, seguito da una disidratazione nel 95% di etanolo per 30 minuti e due immersioni di etanolo al 100% di cinque minuti. Quindi, cancellare le diapositive due immersioni in xilene di cinque minuti, seguite dall'asciugatura ad aria.
Quindi montare le diapositive con il supporto di montaggio per la visualizzazione tramite microscopia ottica. Nei gruppi normali mal gestiti, non si osserva alcun infarto cerebrale;mentre nel controllo, animali MCAO non trattati, si osserva una gamma relativamente ampia di aree danneggiate. Nei topi modello trattati con GRex da 300 milligrammi per chilogrammo, si osserva una riduzione statisticamente significativa del tessuto danneggiato.
L'analisi istologica delle sezioni h&e e dei tessuti macchiati di viola cresile fornisce un indice di sopravvivenza cellulare. In effetti, le intensità di colorazione H&E e cresil violetta diminuiscono significativamente nel gruppo MCAO non trattato rispetto al gruppo normale gestito da sham. Gli animali trattati con GRex, d'altra parte, mostrano una maggiore integrità istologica, implicando meno morte cellulare neuronale rispetto ai gruppi di controllo, non trattati e gestiti da sham, suggerendo un potente effetto neuroprotettivo dell'estratto contro la lesione cerebrale indotta da riperfusione di ischemia.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare il flusso sanguigno cerebellare relativo durante questo periodo. E conduttori di processi con molta attenzione per ridurre al minimo i danni agli strati endoteliali del
