הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה המארח-פתוגן כגון פתוגניות וארסיות של זיהום חיידקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להעריך את הרעילות בין ובתוך מינים אירומונים ולתרום להבנתנו את הפתוגנזה של זיהום אירומונים. כדי להתחיל לשטוף כ 2,000 תולעים בוגרות gravid עם מים סטריליים deionized.

חזור על לשטוף שלוש פעמים שמירה על התולעים בתחתית הצינור. לאחר צנטריפוגה התולעים להסיר את supernatant ולשמור את התולעים 3.5 מיליליטר של מים deionized. הוסף מיליליטר אחד של hypochlorite נתרן ו 0.5 מיליליטר של אשלגן הידרוקסידי לצינור.

ואז לנער את הצינור במשך שש דקות כדי lyse גופות התולעת. לאחר הביצים משתחררות, מוסיפים 10 מיליליטר של מים deionized כדי לעצור את התסיסה. ואז צנטריפוגה הצינור כדי למשוך את הביצים ולהסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר.

לשטוף את הביצים עם 15 מיליליטר של M9 בינוני לפחות שלוש פעמים. מעבירים את הביצים לתבשיל באורך 3.5 ס"מ, ומטגנים אותן ב-20 מעלות צלזיוס ללילה אחד. לאחר מכן להסיר 10 microliters של תולעים L1 ו M9 בינוני מהצלחת.

לספור את התולעים ולקבל את הריכוז של תולעי L1 במדיום M9. באמצעות פיפטה לקחת 0.5 מיליליטר של מרק E.coli OP50 LB ולהפיץ אותו על צלחת ENGM. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות.

מצננים את ה-ENGM לטמפרטורת החדר. ואז זרעים דגירה תולעי L1 על צלחת ENGM עם E.coli OP50. דגירה התולעים ב 20 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב L4.

ראשית, בחר מושבה אחת של כל אחד מארבעת הזנים אירומונס ותרבות אותם על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן למדוד את ספיגת OD 600 של מרק חיידקי ולהתאים אותו עד הספיגה שווה 2.0. הנקודה הבאה ולהפיץ 30 microliters של מרק חיידקים מכל זן לתוך צלחות NGM.

בחר והעבר באופן אקראי את תולעי L4 שהוכנו בעבר לצלחות NGM עם זני אירומונים. ואז לה הדגירה את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד ההתזה הושלמה. כל יום להעביר את כל התולעים החיים לצלחת NGM חדשה עם חיידקים.

לספור את המספרים של תולעים חיות, מתות וחיישנים בכל יום עד שהתולעת האחרונה מתה. לאחר culturing זני אירומונים ומדידת ספיגתם כפי שתואר קודם לכן, צנטריפוגה מרק חיידקי ב 3, 500 גרם של במשך 15 דקות. התאימו את מרק החיידקים עם S Medium.

ומוסיפים 195 מיקרוליטרים של מרק חיידקים במדיום S לשמונה בארות של צלחת 96 בארות. לשטוף את התולעים את צלחת ENGM איתם M9 בינוני. ואז להתאים את הריכוז של פתרון התולעת לחמש תולעים לכל microliter.

הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון התולעת לכל אחת מה בארות של צלחת 96 בארות. דגירה הצלחת על שייקר, ולספר את מספר התולעים חיות ב 24, 48 ו 72 שעות. לאחר culturing זני Aeromonas והתאמת הספיגה על פי נקודת פרוטוקול הטקסט ולהפיץ את המרק החיידקי על צלחות NGM.

לאחר מכן, להעביר 50 תולעים L4 לכל צלחת NGM. כל 24 שעות מעבירים את התולעים לצלחות NGM טריות. בחר באופן אקראי 10 תולעים והעבר אותן לג'ל 2%agarose במדיום M9 בשקופית.

לבסוף למקם כיסוי על הג'ל וללכוד תמונות שרירים עם מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה. בפרוטוקול זה הוערכו הרעילות של ארבעה זני אירומונים. שיעור ההישרדות של C.elegans נגועים במין אירומונים היה הגבוה ביותר ב- assays באמצעות A.caviae, והנמוך ביותר ב- assays באמצעות A.dhakensis.

בהישרדות רעילות נוזלית של C.elegans ירד באופן משמעותי כאשר נגוע A.dhakensis או A.hydrophilia. בשריר נמק דרגות של נזק לשרירים השתנו בין המינים Aeromonas. A.caviae גרם לנזק השרירי לפחות, בעוד A.dhakensis הפיק את הנזק השרירי ביותר.

השיטות המתוארות בסרטון זה מציעות דרך נוחה להבדיל בין מגוון ארסיות בין המינים אירומונים ובתוךם. בנוסף, זהו גם מודל אמין שבו ללמוד את האינטראקציה בין פתוגן ומארח.