Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação hospedeiro-patógeno, como a patogenicidade e virulência da infecção bacteriana. A principal vantagem dessa técnica é que podemos avaliar a toxicidade entre e dentro das espécies aeromonas e contribuir para a nossa compreensão da patogênese da infecção por Aeromonas. Para começar a lavar aproximadamente 2.000 vermes adultos gravid com água deionizada estéril.
Repita a lavagem três vezes mantendo os vermes na parte inferior do tubo. Depois de centrifugar os vermes remover o supernasce e manter os vermes em 3,5 mililitros de água deionizada. Adicione um mililitro de hipoclorito de sódio e 0,5 mililitros de hidróxido de potássio ao tubo.
Em seguida, agite o tubo por seis minutos para lise os corpos dos vermes. Depois que os ovos forem liberados, adicione 10 mililitros de água deionizada para parar a lise. Em seguida, centrifugar o tubo para puxar para baixo os ovos e remover o máximo possível do supernante.
Lave os ovos com 15 mililitros de M9 médio pelo menos três vezes. Transfira os ovos para um prato de 3,5 centímetros e incuba-os a 20 graus Celsius por uma noite. Depois disso remova 10 microliters de vermes L1 e meio M9 da placa.
Conte os vermes e obtenha a concentração de vermes L1 no meio M9. Usando uma pipeta pegue 0,5 mililitros de caldo E.coli OP50 LB e espalhe-o em uma placa ENGM. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas.
Esfrie o ENGM à temperatura ambiente. Em seguida, a semente incubava vermes L1 em uma placa ENGM com E.coli OP50. Incubar os vermes a 20 graus Celsius até chegarem ao estágio L4.
Primeiro, selecione uma única colônia de cada uma das quatro cepas aeromonas e culta-as de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, meça a absorvância OD 600 do caldo bacteriano e ajuste-o até que a absorção seja igual a 2.0. Próximo ponto e espalhar 30 microliters de caldo bacteriano de cada cepa em placas de NGM.
Selecione aleatoriamente e transfira os worms L4 previamente preparados para as placas de NGM com as cepas de Aeromonas. Em seguida, incubar as placas a 20 graus Celsius até que o ensaio esteja completo. Todos os dias transfere todos os vermes vivos para uma nova placa de NGM com bactérias.
Conte o número de vermes vivos, mortos e sensores todos os dias até que o último verme esteja morto. Depois de esculpir cepas de Aeromonas e medir sua absorvância como descrito anteriormente, centrifugar o caldo bacteriano a 3.500 g's por 15 minutos. Ajuste o caldo bacteriano com S Medium.
E adicione 195 microliters de caldo bacteriano no meio S a oito poços de uma placa de 96 poços. Lave os vermes da placa ENGM com eles meio M9. Em seguida, ajuste a concentração da solução de vermes para cinco vermes por microliter.
Adicione cinco microliters da solução de vermes para cada um dos poços da placa de 96 poços. Incubar a placa em um shaker, e contar o número de vermes vivos em 24, 48 e 72 horas. Depois de esculpir cepas aeromonas e ajustar a absorvência de acordo com a mancha do protocolo de texto e espalhar o caldo bacteriano nas placas de NGM.
Depois disso, transfira 50 worms L4 para cada placa NGM. A cada 24 horas transfira os vermes para novas placas de GNM. Selecione aleatoriamente 10 worms e transfira-os para um gel de 2%agarose no meio M9 em um slide.
Por fim, posicione uma mancha no gel e capture imagens musculares com um filtro de proteína fluorescente verde em um microscópio fluorescente equipado com uma câmera. Neste protocolo foram avaliadas as toxicidades de quatro cepas aeromonas. A taxa de sobrevivência de C.elegans infectados com espécies de Aeromonas foi mais alta em ensaios usando A.caviae, e menor em ensaios usando A.dhakensis.
Em um ensaio de toxicidade líquida, a sobrevivência de C.elegans diminuiu significativamente quando infectada com A.d.a.escrifez ou A.hidrofilia. No ensaio da necrose muscular os graus de dano muscular variaram entre as espécies de Aeromonas. A.caviae causou o menor dano muscular, enquanto a A.dhakensis produziu a maior dano muscular.
Os métodos descritos neste vídeo oferecem uma maneira conveniente de diferenciar a diversidade de virulência entre e dentro das espécies de Aeromonas. Além disso, é também um modelo confiável para estudar a interação entre um patógeno e um hospedeiro.
