Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, такие как патогенность и вирулентность бактериальной инфекции. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем оценить токсичность среди и внутри видов Aeromonas и способствовать нашему пониманию патогенеза инфекции Aeromonas. Чтобы начать мыть около 2000 гравид взрослых червей со стерильной деионизированной водой.
Повторите мыть три раза держать червей на дне трубки. После центрифугирования черви удаляют супернатант и держат червей в 3,5 миллилитров деионизированной воды. Добавьте в трубку один миллилитр гипохлорита натрия и 0,5 миллилитров гидроксида калия.
Затем встряхните трубку в течение шести минут, чтобы подставить тела червя. После того, как яйца будут выпущены, добавьте 10 миллилитров деионизированной воды, чтобы остановить лиз. Затем центрифуга трубки, чтобы вытащить яйца и удалить как можно больше супернатантов, как это возможно.
Вымойте яйца с 15 миллилитров M9 среднего по крайней мере три раза. Перенесите яйца на 3,5-сантиметровое блюдо и инкубировать их при 20 градусах по Цельсию в течение одной ночи. После этого удалить 10 микролитров L1 червей и M9 среды из пластины.
Подсчитайте червей и получить концентрацию червей L1 в среде M9. С помощью пипетки возьмите 0,5 миллилитров бульона E.coli OP50 LB и выложить его на пластину ENGM. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 16 до 18 часов.
Охладите ENGM до комнатной температуры. Затем семена инкубировали червей L1 на пластине ENGM с E.coli OP50. Инкубировать червей при 20 градусах по Цельсию, пока они не достигнут стадии L4.
Во-первых, выберите одну колонию каждого из четырех штаммов Aeromonas и культуры их в соответствии с текстовым протоколом. Затем измерьте абсорбаность бактериального бульона OD 600 и отрегулируйте его до тех пор, пока поглощение не будет равным 2.0. Следующее пятно и распространение 30 микролитров бактериального бульона из каждого штамма в NGM пластин.
Случайным образом выберите и перенесите ранее подготовленных червей L4 на пластины NGM с штаммами Aeromonas. Затем инкубировать пластины при 20 градусах по Цельсию, пока анализ не будет завершен. Каждый день перенесите всех живых червей на новую пластину NGM с бактериями.
Подсчитайте количество живых, мертвых и сенсорных червей каждый день, пока последний червь не умрет. После культивирования штаммов Aeromonas и измерения их поглощения, как описано ранее, центрифуга бактериального бульона на 3500 г в течение 15 минут. Отрегулируйте бактериальный бульон с помощью S Medium.
И добавить 195 микролитров бактериального бульона в S средних до восьми скважин 96-хорошо пластины. Вымойте червей от пластины ENGM с ними M9 среды. Затем отрегулируйте концентрацию раствора червя до пяти червей на микролитер.
Добавьте пять микролитров раствора червя в каждую из колодцев пластины из 96 скважин. Инкубировать пластину на шейкере, и подсчитать количество живых червей на 24, 48 и 72 часов. После культивирования штаммов Aeromonas и регулировки абсорбтности в соответствии с текстовым протоколом пятно и распространение бактериального бульона на ngM пластин.
После этого перенесите 50 червей L4 на каждую пластину NGM. Каждые 24 часа перенесите червей на свежие пластины NGM. Случайным образом выберите 10 червей и перенесите их в гель 2%agarose в среде M9 на слайде.
Наконец положение coverslip на гель и захватить мышечные изображения с зеленым флуоресцентным фильтром белка на флуоресцентный микроскоп оснащен камерой. В этом протоколе были оценены токсичности четырех штаммов Aeromonas. Выживаемость C.elegans инфицированных видами Aeromonas был самым высоким в анализах с использованием A.caviae, и самый низкий в анализах с использованием A.dhakensis.
В жидкой токсичности анализ выживаемости C.elegans значительно снизилась при инфицировании A.dhakensis или A.hydrophilia. В мышечном некрозе степень повреждения мышц варьировалась среди видов Aeromonas. A.caviae вызвало наименьшее повреждение мышц, в то время как A.dhakensis производится наиболее повреждения мышц.
Методы, описанные в этом видео, предлагают удобный способ дифференцировать разнообразие вирулентности среди видов Aeromonas и внутри них. Кроме того, это также надежная модель, с помощью которой для изучения взаимодействия между патогеном и хозяином.
