Bu yöntem, bakteriyel enfeksiyonun patojenitesi ve virülansı gibi konak-patojen etkileşim alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, Aeromonas türleri arasındaki toksisiteyi değerlendirebilmek ve Aeromonas enfeksiyonunun patogenezi anlayışımıza katkıda bulunmaktır. Steril deiyonize su ile yaklaşık 2.000 gravid yetişkin solucanlar yıkamabaşlamak için.
Solucanları tüpün dibinde tutarak yıkamayı üç kez tekrarlayın. Solucanlar santrifüj sonra supernatant kaldırmak ve deiyonize su 3,5 mililitre solucanlar tutun. Tüpe bir mililitre sodyum hipoklorit ve 0,5 mililitre potasyum hidroksit ekleyin.
Daha sonra solucan vücutlarını lyse için altı dakika tüp sallayın. Yumurtalar serbest bırakıldıktan sonra, lysis durdurmak için deiyonize su 10 mililitre ekleyin. Sonra yumurta aşağı çekmek ve mümkün olduğunca supernatant kadar kaldırmak için tüp santrifüj.
Yumurtaları 15 mililitre M9 orta ile en az üç kez yıkayın. Yumurtaları 3.5 santimetrelik bir tabağa aktarın ve bir gece için 20 derecede kuluçkaya yatırın. Bundan sonra 10 mikrolitre L1 solucanı ve M9 ortamını plakadan çıkarın.
Solucanları sayın ve M9 ortamındaki L1 solucanlarının konsantrasyonuna kavuşun. Bir pipet kullanarak E.coli OP50 LB suyu 0.5 mililitre almak ve bir ENGM plaka üzerine yayıldı. Sonra 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derece plaka kuluçka.
ENGM'yi oda sıcaklığına kadar soğutun. Sonra tohum E.coli OP50 ile bir ENGM plaka üzerinde L1 solucanlar kuluçka. Solucanları 20 derecede L4 aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
İlk olarak, dört Aeromonas suşları her tek bir koloni seçin ve metin protokolüne göre onları kültür. Daha sonra bakteriyel et suyu OD 600 emici ölçmek ve emici 2,0 eşit olana kadar ayarlayın. Sonraki nokta ve NGM plakaları içine her suşu bakteriyel suyu 30 mikrolitre yayıldı.
Daha önce hazırlanmış L4 solucanlarını aeromonas suşları ile NGM plakalarına rastgele seçin ve aktarın. Daha sonra plakaları 20 derecede kuluçkaya yatırın ta ki taslı kaynır tamamlanana kadar. Her gün tüm canlı solucanları bakterilerle dolu yeni bir NGM plakasına aktarın.
Son solucan ölene kadar her gün yaşayan, ölü ve sensörsolucanlarının sayısını sayın. Aeromonas suşları kültürve daha önce açıklandığı gibi onların absorbans ölçme sonra, 3, 500 g's 15 dakika bakteriyel suyu santrifüj. Bakteriyel suyu S Medium ile ayarlayın.
Ve 96 kuyulu bir plakanın sekiz kuyusu için S orta bakteri suyu 195 mikrolitre ekleyin. Solucanları ENGM plakasının üzerinde M9 orta sıyla yıkayın. Daha sonra solucan çözeltisinin konsantrasyonunu mikrolitre başına beş solucana ayarlayın.
96 kuyulu plakanın her kuyuya solucan çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Plakayı bir çalkalayıcıya yerleştirin ve canlı solucan sayısını 24, 48 ve 72 saat olarak sayın. Aeromonas suşları kültürve metin protokolü noktaya göre emici ayar ve NGM plakaları üzerinde bakteriyel suyu yayıldı sonra.
Bundan sonra, her NGM plaka 50 L4 solucanlar aktarın. Her 24 saatte bir solucanları taze NGM plakalarına aktarın. Rastgele 10 solucan seçin ve bir slayt üzerinde M9 ortamda% 2 agarose jel aktarın.
Son olarak jel üzerinde bir coverslip konumlandırmak ve bir kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop üzerinde yeşil floresan protein filtresi ile kas görüntüleri yakalamak. Bu protokolde dört Aeromonas suşunun toksisitesi değerlendirildi. Aeromonas türleri ile enfekte C.elegans sağkalım oranı A.caviae kullanarak tahlillerde en yüksek, a.dhakensis kullanarak tahlillerde en düşük oldu.
Bir sıvı toksisite tisöz titrek töz c.elegans sağkalım önemli ölçüde zaman A.dhakensis veya A.hydrophilia ile enfekte azalmıştır. Kas nekroz istinat derecelerinde aeromonas türleri arasında çeşitli kas hasarı. En az kas hasarına a.caviae neden olurken, en fazla kas hasarına a.dhakensis neden oldu.
Bu videoda açıklanan yöntemler Aeromonas türleri arasında ve içinde virülans çeşitliliğini ayırt etmek için uygun bir yol sunuyoruz. Ayrıca, aynı zamanda bir patojen ve konak arasındaki etkileşimi incelemek için güvenilir bir modeldir.
