تقييم الفوعة والمرضية للعدوى أيروموناس في نموذج ايليجانس كاينورهابديتيس

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعل بين المضيف والمسببات مثل الإمراضية ووعة العدوى البكتيرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تقييم السمية بين الأنواع Aeromonas وداخلها والمساهمة في فهمنا للأمراض من عدوى Aeromonas. لبدء غسل ما يقرب من 2،000 الديدان الكبار غرافيد مع المياه المعقمة deionized.

كرر الغسيل ثلاث مرات مع الحفاظ على الديدان في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد الطرد المركزي الديدان إزالة ناطورة والحفاظ على الديدان في 3.5 ملليلتر من المياه الأيونية. إضافة ملليلتر واحد من هيبوكلوريت الصوديوم و 0.5 ملليلتر من هيدروكسيد البوتاسيوم إلى الأنبوب.

ثم يهز الأنبوب لمدة ست دقائق لزعزعة الهيئات الدودة. بعد أن يتم تحرير البيض ، أضف 10 ملليلتر من الماء الأيوني لوقف التحلل. ثم الطرد المركزي أنبوب لسحب أسفل البيض وإزالة أكبر قدر من افرانير ممكن.

اغسل البيض بـ 15 ملليلتر من M9 متوسطة ثلاث مرات على الأقل. نقل البيض إلى طبق 3.5 سنتيمتر، واحتضان لهم في 20 درجة مئوية لليلة واحدة. بعد هذا إزالة 10 ميكروليتر من الديدان L1 ومتوسطة M9 من لوحة.

عد الديدان والحصول على تركيز الديدان L1 في المتوسط M9. باستخدام ماصة تأخذ 0.5 ملليلتر من مرق E.coli OP50 LB ونشرها على لوحة ENGM. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة.

تبريد ENGM إلى درجة حرارة الغرفة. ثم البذور المحتضنة L1 الديدان على لوحة ENGM مع E.coli OP50. احتضان الديدان في 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4.

أولاً، حدد مستعمرة واحدة لكل من سلالات Aeromonas الأربعة وثقافتها وفقًا لبروتوكول النص. ثم قياس امتصاص 600 OD من مرق البكتيرية وضبطه حتى امتصاص يساوي 2.0. بقعة المقبل وانتشار 30 ميكرولترات من مرق البكتيرية من كل سلالة في لوحات NGM.

عشوائيا اختيار ونقل الديدان L4 أعدت سابقا إلى لوحات NGM مع سلالات Aeromonas. ثم احتضان لوحات في 20 درجة مئوية حتى اكتمال الفحص. كل يوم نقل كل من الديدان الحية إلى لوحة NGM جديدة مع البكتيريا.

عد أعداد الديدان الحية والأموات وأجهزة الاستشعار كل يوم حتى تموت الدودة الأخيرة. بعد زراعة سلالات Aeromonas وقياس امتصاصها كما هو موضح سابقًا ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بالمرق البكتيري في 3500 جرام لمدة 15 دقيقة. ضبط مرق البكتيرية مع S المتوسطة.

وإضافة 195 ميكرولترات من مرق بكتيري في S المتوسطة إلى ثمانية آبار من لوحة 96 جيدا. غسل الديدان قبالة من لوحة ENGM معهم M9 المتوسطة. ثم ضبط تركيز حل الدودة إلى خمسة الديدان لكل ميكرولتر.

إضافة خمسة ميكرولترات من حل دودة إلى كل من الآبار من لوحة 96-جيدا. احتضان لوحة على شاكر، وفرز عدد الديدان الحية في 24 و 48 و 72 ساعة. بعد زراعة سلالات Aeromonas وضبط الامتصاص وفقا لبروتوكول النص بقعة ونشر مرق البكتيرية على لوحات NGM.

بعد ذلك، نقل 50 الديدان L4 إلى كل لوحة NGM. كل 24 ساعة تنقل الديدان إلى لوحات NGM جديدة. اختر عشوائيا 10 ديدان ونقلها إلى هلام agarose 2 ٪في M9 المتوسطة على شريحة.

وأخيرا وضع غطاء على هلام والتقاط الصور العضلية مع مرشح البروتين الفلورسنت الأخضر على مجهر الفلورسنت مجهزة كاميرا. في هذا البروتوكول تم تقييم سمية أربع سلالات Aeromonas. وكان معدل البقاء على قيد الحياة من C.elegans المصابة بأنواع Aeromonas أعلى في المقايسات باستخدام A.caviae، وأدنى في المقايسات باستخدام A.dhakensis.

في اختبار السمية السائلة البقاء على قيد الحياة من C.elegans انخفض بشكل ملحوظ عندما المصابين ب A.dhakensis أو A.hydrophilia. في العضلات نخر درجة من الضرر العضلات متفاوتة بين الأنواع Aeromonas. تسبب الكافافي في أقل تلف عضلي، في حين أن A.dhakensis أنتجت معظم تلف العضلات.

توفر الطرق الموصوفة في هذا الفيديو طريقة مريحة للتمييز بين تنوع الفوعة بين الأنواع Aeromonas وداخلها. بالإضافة إلى ذلك ، هو أيضا نموذج موثوق به لدراسة التفاعل بين مسببات الأمراض والمضيف.