Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’interaction hôte-pathogène telles que la patho pathogène et la virulence de l’infection bactérienne. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer la toxicité parmi et au sein des espèces d’Aeromonas et contribuer à notre compréhension de la pathogénie de l’infection d’Aeromonas. Pour commencer à laver environ 2000 vers adultes gravid avec de l’eau déionisée stérile.
Répétez le lavage trois fois en gardant les vers au fond du tube. Après avoir centrifugé les vers enlever le supernatant et garder les vers dans 3,5 millilitres d’eau déionisée. Ajouter un millilitre d’hypochlorite de sodium et 0,5 millilitres d’hydroxyde de potassium au tube.
Puis secouez le tube pendant six minutes pour lyser le corps du ver. Après la libération des œufs, ajouter 10 millilitres d’eau déionisée pour arrêter la lyse. Puis centrifuger le tube pour tirer vers le bas les oeufs et enlever autant de supernatant que possible.
Laver les œufs avec 15 millilitres de M9 moyen au moins trois fois. Transférer les œufs dans un plat de 3,5 centimètres et les incuber à 20 degrés Celsius pendant une nuit. Après cela enlever 10 microlitres de vers L1 et M9 moyen de la plaque.
Comptez les vers et obtenez la concentration de vers L1 dans le milieu M9. À l’aide d’une pipette, prendre 0,5 millilitres de bouillon E.coli OP50 LB et l’étendre sur une plaque ENGM. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures.
Refroidir l’ENGM à température ambiante. Puis graines incubées vers L1 sur une plaque ENGM avec E.coli OP50. Incuber les vers à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.
Tout d’abord, sélectionnez une seule colonie de chacune des quatre souches Aeromonas et culturez-les selon le protocole du texte. Mesurez ensuite l’absorption de l’OD 600 du bouillon bactérien et ajustez-le jusqu’à ce que l’absorption soit égale à 2,0. Place suivante et étaler 30 microlitres de bouillon bactérien de chaque souche dans les plaques NGM.
Sélectionnez et transférez au hasard les vers L4 précédemment préparés dans les plaques NGM avec les souches Aeromonas. Puis incuber les plaques à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que l’essai soit terminé. Chaque jour, transférez tous les vers vivants dans une nouvelle plaque NGM avec des bactéries.
Comptez le nombre de vers vivants, morts et capteurs chaque jour jusqu’à ce que le dernier ver soit mort. Après avoir culture des souches d’Aeromonas et mesuré leur absorption comme décrit précédemment, centrifugez le bouillon bactérien à 3 500 g pendant 15 minutes. Ajuster le bouillon bactérien avec S Medium.
Et ajouter 195 microlitres de bouillon bactérien dans le milieu S à huit puits d’une plaque de 96 puits. Lavez les vers de la plaque ENGM avec eux M9 moyen. Ajustez ensuite la concentration de la solution vermifuge à cinq vers par microlitre.
Ajouter cinq microlitres de la solution vermifuge à chacun des puits de la plaque de 96 puits. Incuber la plaque sur un shaker, et compter le nombre de vers vivants à 24, 48 et 72 heures. Après avoir culturer les souches Aeromonas et ajusté l’absorption en fonction de la tache de protocole de texte et de répandre le bouillon bactérien sur les plaques NGM.
Après cela, transférer 50 vers L4 à chaque plaque NGM. Toutes les 24 heures, transférer les vers dans des assiettes NGM fraîches. Sélectionnez au hasard 10 vers et transférez-les sur un gel d’agarose de 2% dans le milieu M9 sur une diapositive.
Enfin, placez un coverslip sur le gel et capturez des images musculaires avec un filtre à protéines fluorescentes vertes sur un microscope fluorescent équipé d’une caméra. Dans ce protocole, les toxicités de quatre souches d’Aeromonas ont été évaluées. Le taux de survie des C.elegans infectés par des espèces d’Aeromonas était le plus élevé dans les analyses utilisant A.caviae, et le plus bas dans les analyses utilisant A.dhakensis.
Dans un essai de toxicité liquide, la survie de C.elegans a diminué de façon significative lorsqu’elle était infectée par A.dhakensis ou A.hydrophilia. Dans la nécrose musculaire, les degrés d’analyse des lésions musculaires variaient d’une espèce d’Aeromonas à l’autre. A.caviae a causé le moins de dommages musculaires, tandis que A.dhakensis a produit le plus de dommages musculaires.
Les méthodes décrites dans cette vidéo offrent un moyen pratique de différencier la diversité des virulences entre et au sein des espèces Aeromonas. En outre, il s’agit également d’un modèle fiable par lequel étudier l’interaction entre un agent pathogène et l’hôte.
