病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

この方法は、細菌感染の病原性および病原性などの宿主病原体相互作用分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、アエロモナス種間およびアエロモナス種内の毒性を評価し、アエロモナス感染の病因の理解に貢献できることです。滅菌脱イオン水で約2,000グレイド成虫を洗浄し始める。

チューブの底にワームを保つ洗浄を3回繰り返します。遠心分離後、ワームは上清を除去し、3.5ミリリットルの脱イオン水に保管します。次亜塩素酸ナトリウム1ミリリットルと水酸化カリウム0.5ミリリットルをチューブに加えます。

その後、ワームの体をライスするために6分間チューブを振ります。卵が放出された後、10ミリリットルの脱イオン水を加えて、リシスを止めます。その後、卵を引き下げ、できるだけ多くの上清を取り除くためにチューブを遠心分離します。

M9培地15ミリリットルで卵を少なくとも3回洗います。卵を3.5センチメートルの皿に移し、1泊摂氏20度でインキュベートします。この後、プレートからL1ワームとM9培地の10マイクロリットルを除去します。

ワームを数え、M9培地中のL1ワームの濃度を取得します。ピペットを使用すると、0.5ミリリットルの大腸菌OP50 LBスープを取り、ENGMプレートに広げます。その後、16〜18時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。

ENGMを室温まで冷却します。その後、大腸菌OP50とENGMプレートにL1ワームをインキュベートシード。彼らはL4段階に達するまで、摂氏20度でワームをインキュベート。

まず、4つのアエロモナス株のそれぞれの単一コロニーを選択し、テキストプロトコルに従ってそれらを培養する。次に、細菌性ブロスのOD600吸光度を測定し、吸光度が2.0に等しくなるまで調整します。次のスポットとNGMプレートに各株から細菌のスープの30マイクロリットルを広げます。

ランダムに選択し、アエロモナス株とNGMプレートに以前に調製したL4ワームを転送します。その後、アッセイが完了するまで20°Cでプレートをインキュベートします。毎日生きているワームのすべてを細菌と新しいNGMプレートに移します。

最後のワームが死ぬまで、毎日生きている、死んでいる、センサーのワームの数を数える。前述のようにアエロモナス株を培養し、その吸光度を測定した後、細菌のスープを3、500gで15分間遠心する。細菌のスープをS培地で調整します。

そして、96ウェルプレートの8つの井戸にS培地に細菌スープの195マイクロリットルを追加します。彼らはM9培地でENGMプレートからワームを洗い流します。次に、マイクロリットル当たり5ワームにワーム溶液の濃度を調整します。

96ウェルプレートの各ウェルにワーム溶液の5マイクロリットルを追加します。シェーカーにプレートをインキュベートし、24、48、72時間で生きたワームの数を数えます。アエロモナス株を培養し、テキストプロトコルスポットに応じて吸光度を調整し、NGMプレート上に細菌のスープを広めた後。

この後、50 L4ワームを各NGMプレートに移します。24時間ごとに、ワームを新鮮なNGMプレートに移します。ランダムに10のワームを選択し、スライド上のM9培地で2%アガロースゲルに移します。

最後に、カバースリップをゲルに配置し、カメラを搭載した蛍光顕微鏡上の緑色蛍光タンパク質フィルターで筋肉画像をキャプチャします。このプロトコルでは、4つのアエロモナス株の毒性が評価された。アエロモナス種に感染したC.エレガンスの生存率は、A.キャビアを使用したアッセイで最も高く、A.dhakensisを使用したアッセイでは最も低かった。

液体毒性アッセイでは、A.dhakensisまたはA.親水性に感染すると、C.elegansの生存率が有意に低下した。筋肉壊死アッセイでは、アエロモナス種の間で筋肉の損傷の程度が異なった。A.キャビアは筋肉の損傷を最も少ない原因とし、A.dhakensisは最も筋肉の損傷を引き起こした。

このビデオで説明されている方法は、アエロモナス種間およびアエロモナス種内の毒性の多様性を区別するための便利な方法を提供します。さらに、病原体と宿主の間の相互作用を研究するための信頼できるモデルでもあります。