פרוטוקול זה מספק לטווח ארוך, במבחנה, שיטה תפקודית להערכת קולטן אנטיגן כימרי, או תאי T CAR, באמצעות אתגר תא גידול חוזר. טכניקה זו היא פחות זמן רב, ופחות עבודה אינטנסיבית מאשר vivo CAR T תפקוד התא הערכה תוך השגת ייצוג מדויק של היעילות האמיתית נגד הגידול. טכניקה זו במבחנה מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה והתמיינות של עוצמת אנטי גידול תא T CAR.
אשר יש את היישום הפוטנציאלי להערכת יעילות קלינית של מוצרי תא T רכב. התחל על ידי ניתוס גידולים גליובלסטומה מתרבות גידול גליובלסטומה. עם מיליליטר אחד של אקוטאז קר, ו-30 עד 60 שניות של צינורות.
כאשר הגידולים שובשו, לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום שיתוף תרבות חם. ו גלולה מתלי תא הגידול על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים גליובלסטומה ל 1.6 פעמים 10 לתאי הגידול החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני coculture טרי, ולדלל תאי T שנקטפו מתרבות תאים CAR T לאחוז המתאים של תאי T חיוביים CAR למיליליטר של ריכוז בינוני שיתוף תרבות.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תאים סרטניים מדוללים לכל באר של 96 צלחת תכלית רקמה תחתונה שטוחה היטב. ו-100 מיקרוליטרים של תאי CAR T לכל באר של תאי גידול עם ערבוב עדין. ואז למקם את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.
בימים 2, 4 ו-6 של תרבות, הסר בזהירות 50 מיקרוליטרים של מדיום מכל באר של תא הגידול, לוחית תא T המיועדת לריכלנגה על פי השולחן. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של השעיה תא גליובלסטומה טרי, מוכן כפי שהוכח רק, אבל עם מספר תא כפול של שיתוף התרבות הראשונית לכל באר עם ערבוב עדין. ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבות התא.
ימים אחד, שלושה, חמישה ושבעה של תרבות משותף, להעביר את supernatant מכל באר כדי להיות שנקטפו לתוך צלחת תחתונה חדשה 96 גם עגול על פי השולחן ולהוסיף 50 microliters של מראש מחומם 0.5% טריפסין EDTA לתוך כל בינוני מדולדל היטב. לאחר חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לאשר כי התאים התנתקו מהתחתית של כל באר על ידי מיקרוסקופ אור, בעדינות pipette פתרון האנזים סביב החלק התחתון של כל באר כדי לעכל מחדש את התאים. לפני העברת ההשעיה התא מנותק לתוך הבארים המתאימים המתאימים של צלחת 96 בארות חדשה.
גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את התאים עם 200 microliters של פלואורסצנטיים מופעל תא מיון פתרון עומד, או FFS ל הבאר עם צנטריפוגה שנייה. להשעות מחדש את כדורי 100 microliters של קוקטייל נוגדנים עניין 100 microliters של SSS ל הבאר עבור דגירה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. סוף הדגירה להסיר כל נוגדן מאוגד על ידי רציף 100 ו 200 microliter FSS שוטף מחדש להשעות את התאים ב 100 כדי 200 microliters של כתם גרעיני DAPI ו FSS.
לאחר מכן, לנתח את התאים על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. לניתוח פונקציונלי ופנוטיפי של תאי CAR T לאחר תא הגידול שיתוף תרבות, לאחזר את קבצי הנתונים מן ציטומטר הזרימה, ושער כל התאים השליליים DAPI לחיות. כדי לכמת את תאי הגידול, שער האוכלוסייה השלילית CD45.
כדי לכמת את תאי T CAR שער CD45 חיובי CAR אוכלוסייה חיובית. לאחר מכן לתכנן את הגידול ואת מספרי תאים CAR T במהלך הזמן של הניסוי, זיהוי הפעלת תא T על ידי ביטוי שותף של 41BB, ו CD69. תשישות תאי T על-ידי הביטוי PD1, LAG3 ו- TIM3, מצב זיכרון תא T LAG3 ו- TIM3, ו מצב זיכרון תא T על-ידי CD45RO וביטוי ליגנד CD62.
לפי CD45RO וביטוי ליגנד CD62. הן CD4 חיובי, ו CD8 חיובי CAR T תאים להיות מופעל באותה מידה נגד תאים גליובלסטומה המבטאים את אנטיגן היעד כפי שצוין על ידי CD107a שלהם ביטוי ציטוקיני תאית. עם זאת, כפי שהוערך על ידי אתגר גידול חוזר SA, CD4 חיובי, אבל לא CD8 חיובי, תאי CAR T מסוגלים הרג עגול מרובים.
CD4 חיובי CAR T תאים גם להשיג הרחבה חזקה יותר. כאשר CD4 חיובי, ו CD8 חיובי CAR T תאים מעורבבים ביחס אחד לאחד, שילוב תא זה החוצה מבצע CD8 חיובי, אבל לא CD4 חיובי CAR T תאים במונחים של cytotoxicity לטווח ארוך. בנוסף, ההתרחבות של CD8 חיובית תאי CAR T נגרמת על ידי תוספת של CD4 תאי T חיוביים.
בעוד CD4 חיובי CAR T הרחבת תא מעוכב בנוכחות תאים חיוביים CDa. 24 שעות לאחר שיתוף התרבות הראשונית, הן CD4 חיובי ו CD8 חיובי CAR T תאים מופעלים באופן דומה. במהלך אתגר הגידול החוזר על עצמו, הן CD4 חיובי ו CD8 חיובי CAR T תאים להדגים מעבר מ CD45RO חיובי, CD62 ליגן חיובי זיכרון מרכזי פנוטיפ, כדי CD45RO חיובי CD62 ליגן שלילי אפקטר זיכרון פנוטיפ.
CD8 חיובי CAR T תאים גם נוטים יותר תשישות לעומת CD4 חיובי CAR T תאים כפי שהוערך על ידי PD1 שלהם, LAG3, ו TIM3 ביטוי לאחר שלושה ימים של שיתוף תרבות. יתר על כן, אין הבדלים שנצפו CDa חיובי CAR T תא תשישות בנוכחות או היעדר CD4 חיובי תאי T, המציין כי CD4 המושרה CD8 חיובי CAR T התא הרחבה אינה קשורה לתפקוד משפיע טוב יותר. חיבור זה יכול להיות גם יחד עם מיון תאי T טופס שיתוף התרבות לבצע ניתוח נוסף על transcriptomes, פרותומיקה, וגנים ספציפיים של עניין.
אתגר גידול חוזר זה יכול לשמש גם כפלטפורמה לחקירת האירועים הביולוגיים לאחר זיהוי גידול תא T CAR.
