Este protocolo muestra que la radiación influye en las propiedades de la matriz extracelular del tejido adiposo en la almohadilla de grasa mamaria murina. La adición de radiación en un modelo de decelularización no se ha hecho antes. Esta técnica utiliza varios pasos de lavado que cada uno sirve un propósito químico único en el proceso de descelularización.
La especificidad de esta técnica permite lavados químicos más suaves, para preservar mejor las propiedades del tejido. La recaída del cáncer de mama ocurre después de la terapia, especialmente en casos triples negativos. Evaluar cómo la matriz extracelular irradiada altera el comportamiento de las células tumorales conducirá a descubrimientos importantes sobre los mecanismos de recurrencia.
Después de irradiar muestras, utilizando una fuente de cesio, transfiera los MFP irradiados y los medios RPMI completos a un gabinete de bioseguridad. Llene los platos de seis centímetros o 10 centímetros con medios suficientes para sumergir los equipos multifunción. Incubar a 37 grados centígrados, con un 5% de dióxido de carbono, durante dos días.
En primer lugar, coloque los MFP en platos de seis centímetros con cinco mililitros de solución Trypsin-EDTA. Rocíe y limpie los platos con 70% de etanol e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Utilice coladores de 0,7 mililitros para lavar los equipos multifunción con agua desionizada, vertiendo agua sobre el tejido tres veces.
Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados. A continuación, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de tareas y sopesarlo. Coloque los tejidos secos en un vaso de precipitados preautoclavedo, que contenga una barra de agitación de tamaño adecuado y cubra los tejidos con 60 mililitros de 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol por gramo de tejido.
Revuelva durante una hora a temperatura ambiente. Luego arroja el contenido del vaso de precipitados en un colador. Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y vierta esto en los tejidos.
Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues. Después de esto, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y pesar. Coloque los tejidos y las barras de agitación de nuevo en los mismos vasos y cúbralos con 60 mililitros de 4% de ácido desoxicólico por gramo de tejido.
Revuelva a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, vierta el contenido del vaso de precipitados en un colador de malla, enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y vierta esto en los tejidos. Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.
Seque brevemente el tejido enjuagado en una delicada toallita de tarea y sopesarlo. Colocar los tejidos secos en el mismo vaso de precipitados, junto con agua fresca desionizada, complementada con 1%penicilina-estreptomicina. Cubrir el vaso de precipitados firmemente con película de parafina y salir a 4 grados Celsius durante la noche.
Al día siguiente drenar el contenido del vaso de precipitados en un colador, secar brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y pesarlo. A continuación, coloque los equipos multifunción en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubrir el tejido con 60 mililitros de una solución que contenga 4%etanol y 0,1%ácido peracético por gramo de tejido.
Revuelva a temperatura ambiente durante dos horas. Volca el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Use fórceps para masajear manualmente el tejido y volver a colocar el contenido en el vaso de precipitados.
Lavar el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de 1X PBS por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita todo este proceso de lavado una vez más.
A continuación, volque el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Usando fórceps, masajee manualmente el tejido y vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lavar el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de tejido.
Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita todo este proceso de lavado una vez más. Seque brevemente el tejido lavado en una delicada toallita de tarea y sopesarlo.
Vierta el tejido y el contenido en un colador y use fórceps para masajear manualmente el tejido. Coloque el contenido de nuevo en el vaso de precipitados y cubra los tejidos con 60 mililitros de 100%n-propanol por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante una hora.
Luego, seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y sopesarlo. Vierta el tejido y el contenido en un colador de 0,7 milímetros y use fórceps para masajear manualmente el tejido. Coloque el contenido de nuevo en el vaso de precipitados y lave el tejido cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de tejido.
Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repita este proceso de lavado tres veces. Después de esto, seque brevemente el tejido en una delicada limpieza de la tarea y sopesarlo.
Transfiera el tejido a un tubo etiquetado de 15 mililitros y congele a 80 grados Celsius negativos durante la noche. Primero, llene un recipiente poco profundo con nitrógeno líquido. Retire las muestras del congelador y pese cada impresora multifunción liofilizada.
Coloque una muestra en el mortero, use un guante criogénico para sostener el mortero en el nitrógeno líquido. A continuación, utilice un pestillo, unido a un taladro de mano, para fresar la muestra. Fresar en intervalos de un minuto para comprobar el progreso y retirar la mano enguanada del nitrógeno líquido.
Repita este proceso de molienda para todas las muestras, asegurándose de rociar y limpiar el mortero y el pestillo con etanol entre cada muestra. Almacene las muestras en polvo en tubos de 15 mililitros a 80 grados Celsius negativos hasta que estén listas para usar. Para comenzar, retire las muestras del congelador y descongele a temperatura ambiente.
Mientras las muestras se descongelan, mezcle la pepsina en ácido clorhídrico para formar una solución de Pepsin-HCL. A continuación, agregue el polvo de muestra y la solución Pepsin-HCL a un tubo de 15 mililitros, agregue una pequeña barra de agitación y revuelva durante 48 horas. Después de esto, coloque los tubos en hielo durante cinco minutos.
Agregue 10X PBS a cada muestra, de manera que la solución final tenga una concentración de 1X PBS. A continuación, añada un 10% de volumen/volumen, 0,1 molar de hidróxido sódico a cada solución, para alcanzar el pH 7.4, utilizando papel de pH para probar cada solución individualmente. Usando una solución de gel de pH 7.4, resuspender la GFP peletada y la luciferasa etiquetadas 4T1 a una concentración de 500, 000 o 1.000, 000 células por mililitro de solución de gel.
Agregue 16 microlitros de solución de células de gel a cada pozo de un portaobjetos de cámara de 16 pozos e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, agregue 100 microlitros de medios RPMI completos a cada pozo. Continúe incubando a 37 grados centígrados durante 48 horas.
Luego, utilice un microscopio de fluorescencia para observar las células a una longitud de onda de excitación de 519 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 618 nanómetros. En este estudio, se estudian los efectos normales de la radiación tisular, utilizando hidrogeles de matriz extracelular. La tinción de hematoxilina y eosina se utiliza para confirmar la descelularización, a través de la pérdida de núcleos y otros rastros de ADN.
Mientras que la tinción de aceite rojo O se utiliza para evaluar el contenido de lípidos y confirmar la retención de una morfología dipasím. Las propiedades reológicas de los hidrogeles ECM se evalúan a 37 grados centígrados. El módulo de almacenamiento es mayor que el módulo de pérdida para todas las condiciones, demostrando la formación estable de hidrogeles.
Las células de carcinoma mamario 4T1 etiquetadas con GFP y luciferasa se encapsulan en los hidrogeles. La proliferación celular se examina mediante microscopía de fluorescencia, mediante mediciones de iluminación y tinción de viabilidad, 48 horas después de la encapsulación. Los hidrogeles irradiados muestran una tendencia creciente en la proliferación de células tumorales.
El conjugado de faloide se utiliza para visualizar F-Actin en las células encapsuladas. Recuerde enfriar el mortero antes de colocar el tejido dentro del molino, un mortero caliente puede conducir a un fresado incompleto. Tenga cuidado al manipular n-propanal y pepsina, solo abra n-propanal y otros agentes decellularizatorios bajo una capucha química.
Si es posible, sopese la pepsina bajo una capucha química, ya que hay peligro de inhalación. Los cambios en la composición del ECM después de la irradiación y la decelularización se pueden evaluar mediante espectrometría de masas y espectroscopia de Raman. Además, la estructura de fibra de los hidrogeles ECM se puede analizar mediante microscopía electrónica de barrido.
Este método tiene el potencial de ampliarse para examinar los efectos de la radiación en, no sólo las células tumorales, sino también las células inmunes, así como los tejidos que experimentan daño por radiación, como resultado de la terapia. Esta técnica de descelularización permitirá a los investigadores evaluar las propiedades de la matriz extracelular del tejido después de la radiación, que es una opción de tratamiento importante en la mayoría de los cánceres.
