Este protocolo mostra que a radiação influencia as propriedades da matriz extracelular do tecido adiposo na almofada de gordura mamária murina. A adição de radiação em um modelo de descelularização não foi feita antes. Esta técnica utiliza várias etapas de lavagem que cada uma serve a um propósito químico único no processo de descelularização.
A especificidade desta técnica permite lavagens químicas mais suaves, para preservar melhor as propriedades teciduais. A recaída do câncer de mama ocorre após a terapia, especialmente em casos triplos negativos. Avaliar como a matriz extracelular irradiada altera o comportamento das células tumorais levará a descobertas importantes sobre mecanismos de recorrência.
Depois de irradiar amostras, usando uma fonte de césio, transfira a mídia de MFP irradiada e a mídia RPMI completa para um armário de biossegurança. Encha pratos de seis centímetros ou 10 centímetros com mídia suficiente para submergir os MFP's. Incubar a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, por dois dias.
Primeiro, coloque os MFP's em pratos de seis centímetros com cinco mililitros de solução Trypsin-EDTA. Pulverize e limpe os pratos com 70% de etanol e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Use 0,7 mililitros para lavar os MFP's com água desionizada, derramando água sobre o tecido três vezes.
Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavagens. Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Coloque os tecidos secos em um béquer pré-autoclaved, contendo uma barra de agitação de tamanho apropriado e cubra os tecidos com 60 mililitros de 3%t-octylphenoxypolyethoxyetanol por grama de tecido.
Mexa por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador. Enxágüe o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos.
Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque os tecidos e as barras de mexida de volta nos mesmos béquers e cubra-os com 60 mililitros de ácido desoxicólico de 4% por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de malha, enxágue o béquer com água deionizada e despeje isso nos tecidos. Repita este processo de lavagem mais duas vezes, certificando-se de usar fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues.
Seque brevemente o tecido enxaguado em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Coloque os tecidos secos no mesmo béquer, juntamente com água deionizada fresca, suplementada com 1%penicilina-estreptomicina. Cubra o béquer firmemente com filme de parafina e saia a 4 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, drene o conteúdo do béquer em um coador, seque brevemente o tecido em uma delicada limpeza de tarefas e pese-o. Em seguida, coloque o MFP no mesmo béquer com uma barra de mexida de tamanho apropriado. Cubra o tecido com 60 mililitros de uma solução contendo 4% de etanol e 0,1% de ácido peracético por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por duas horas. Despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Use fórceps para massagear manualmente o tecido e colocar o conteúdo de volta no béquer.
Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de 1X PBS por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez.
Em seguida, despeje o conteúdo do béquer em um coador de 0,7 milímetros. Usando fórceps, massageie manualmente o tecido e coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita todo esse processo de lavagem mais uma vez. Seque brevemente o tecido lavado em uma tarefa delicada limpe e pese-o.
Despeje o tecido e o conteúdo em um coador e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e cubra os tecidos com 60 mililitros de 100% n-propanol por grama de tecido. Mexa em temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o. Despeje o tecido e o conteúdo em um coador de 0,7 milímetros e use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer e lave o tecido cobrindo-o com 60 mililitros de água deionizada por grama de tecido.
Mexa em temperatura ambiente por 15 minutos. Repita este processo de lavagem três vezes. Depois disso, seque brevemente o tecido em uma tarefa delicada limpe e pese-o.
Transfira o tecido para um tubo de 15 mililitros rotulado e congele a 80 graus Celsius negativos durante a noite. Primeiro, encha um recipiente raso com nitrogênio líquido. Retire as amostras do congelador e pese cada MFP liofilizado.
Coloque uma amostra na argamassa, use uma luva criogênica para segurar a argamassa no nitrogênio líquido. Em seguida, use um pilão, preso a uma broca portátil, para moer a amostra. Moer em intervalos de um minuto para verificar o progresso e remover a mão enluvada do nitrogênio líquido.
Repita este processo de moagem para todas as amostras, certificando-se de pulverizar e limpar a argamassa e pilão com etanol entre cada amostra. Armazene as amostras em pó em tubos de 15 mililitros a 80 graus Celsius negativos até estar pronto para usar. Para começar, retire as amostras do congelador e descongele à temperatura ambiente.
Enquanto as amostras estão descongelando, misture a pepsina em ácido clorídrico para formar uma solução Pepsin-HCL. Em seguida, adicione pó de amostra e a solução Pepsin-HCL a um tubo de 15 mililitros, adicione uma pequena barra de mexiça e mexa por 48 horas. Depois disso, coloque os tubos no gelo por cinco minutos.
Adicione 10X PBS a cada amostra, de tal forma que a solução final tenha uma concentração de 1X PBS. Em seguida, adicione 10% de volume/volume, 0,1 hidróxido de sódio molar a cada solução, para atingir o pH 7.4, utilizando papel pH para testar cada solução individualmente. Utilizando uma solução de pH 7.4 gel, resuspenque as células GFP e luciferase de pelotas rotuladas 4T1 a uma concentração de 500, 000 ou 1.000.000 células por mililitro de solução de gel.
Adicione 16 microliters de solução de célula de gel a cada poço de um escorregador de câmara de 16 poços e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, adicione 100 microliters de mídia RPMI completa a cada poço. Continue incubando a 37 graus Celsius por 48 horas.
Em seguida, use um microscópio de fluorescência para observar as células em um comprimento de onda de excitação de 519 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 618 nanômetros. Neste estudo, são estudados efeitos normais da radiação tecidual, utilizando hidrogéis de matriz extracelular. A hematoxilina e a coloração de eosina são usadas para confirmar a descelularização, através da perda de núcleos e outros traços de DNA.
Enquanto a coloração de Óleo Vermelho O é usada para avaliar o conteúdo lipídudo e confirmar a retenção de uma morfologia de dipasite. As propriedades reológicas dos hidrogéis ECM são avaliadas a 37 graus Celsius. O módulo de armazenamento é maior do que o módulo de perda para todas as condições, demonstrando formação estável de hidrogel.
GFP e luciferase rotuladas 4T1 células de carcinoma mamário são então encapsuladas nos hidrogéis. A proliferação celular é examinada por microscopia de fluorescência, por medições de illuminescência e coloração de viabilidade, 48 horas após o encapsulamento. Hidrogéis irradiados mostram uma tendência crescente de proliferação de células tumorais.
O conjugado de falo é usado para visualizar F-Actin nas células encapsuladas. Lembre-se de esfriar a argamassa antes de colocar o tecido dentro do moinho, uma argamassa quente pode levar a moagem incompleta. Tenha cuidado ao manusear n-propanal e pepsina, apenas aberto n-propanal e outros agentes descelularizantes sob uma capa química.
Se possível, pese a pepsina sob uma capa química, pois há perigo de inalação. Alterações na composição do ECM após a irradiação e descelularização podem ser avaliadas utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de Raman. Além disso, a estrutura de fibra dos hidrogéis ECM pode ser analisada por meio da microscopia eletrônica de varredura.
Este método tem o potencial de ser expandido para examinar os efeitos da radiação, não apenas células tumorais, mas também células imunes, bem como tecidos que sofrem danos causados pela radiação, como resultado da terapia. Essa técnica de descelularização permitirá aos pesquisadores avaliar as propriedades da matriz extracelular do tecido após a radiação, que é uma importante opção de tratamento na maioria dos cânceres.
