Bu protokol radyasyon murine meme yağ yastığı yağ dokusunun ekstrasellüler matriks özelliklerini etkilediğini göstermektedir. Bir decellularization modelinde radyasyon ilavesi daha önce yapılmamıştir. Bu teknik, her biri hücre dışılaştırma sürecinde benzersiz bir kimyasal amaca hizmet birkaç yıkama adımları kullanır.
Bu tekniğin özgüllüğü daha iyi doku özelliklerini korumak için, nazik kimyasal yıkar sağlar. Meme kanseri nüks tedavi sonrasında oluşur, özellikle üçlü negatif olgularda. Irradiated ekstrasellüler matriks tümör hücre davranışını nasıl değiştirir değerlendirilmesi nüks mekanizmaları hakkında önemli keşifler yol açacaktır.
Örnekler infüzyon sonra, bir sezyum kaynağı kullanarak, bir biyogüvenlik kabine içine ışınlanmış MFP ve tam RPMI medya aktarın. MFP'leri batıracak kadar ortamla altı santimetre veya 10 santimetrelik tabakları doldurun. 37 derecede kuluçkaya yat, %5 karbondioksitle, iki gün boyunca.
İlk olarak, Trypsin-EDTA çözeltisi beş mililitre ile altı santimetre yemekleri MFP yerleştirin. Sprey ve bir saat boyunca 37 santigrat derece% 70 etanol ve kuluçka ile bulaşıkları silin. MFP'leri üç kez dokuüzerine su dökerek deiyonize suyla yıkamak için 0,7 mililitrelik süzgeçler kullanın.
Yıkarlar arasında dokuel masaj için forceps kullanın. Daha sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Kurutulmuş dokuları, uygun büyüklükte bir stir bar içeren bir ön otoklav kabına yerleştirin ve doku gramı başına %3 t-octylphenoxypolyethoxyetanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın.
Oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Sonra kabın içindekileri bir süzgeçe at. Kabı deiyonize suyla durulayın ve bunu dokuların üzerine dökün.
Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Dokuları ve karıştırma çubuklarını aynı beare geri yerleştirin ve bunları doku gramı başına %4 deoksikolik asit 60 mililitre ile kaplayın.
Bir saat oda sıcaklığında karıştırın. Daha sonra, bir örgü süzgeç içine kabın içeriğini dökümü, deiyonize su ile beher durulayın ve dokuların üzerine dökün. Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun.
Kısa bir süre hassas bir görev üzerinde durulanan doku kuru ve tartmak. Aynı beher içine kurutulmuş dokular yerleştirin, taze deiyonize su ile birlikte, 1% penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir. Kabı parafin filmle sıkıca kapatın ve bir gecede 4 derece santigrat derecede bırakın.
Ertesi gün bir süzgeç içine beher içeriğini drenaj, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Daha sonra, MFP uygun büyüklükte bir karıştırma çubuğu ile aynı beher yerleştirin. Dokuyu gram doku başına %4 etanol ve %0,1 perastik asit içeren bir çözeltinin 60 mililitresi ile kapatın.
İki saat oda sıcaklığında karıştırın. Kabın içindekileri 0.7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Dokuya elle masaj yapmak ve içindekileri kabın içine yerleştirmek için forceps kullanın.
Doku gram başına 1X PBS 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın. 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.
Sonra, kabın içindekileri 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Forceps kullanarak, el ile doku masaj ve kabın içine içeriğini geri yerleştirin. Doku gram başına deiyonize su 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın.
15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Yıkanmış dokuyu hassas bir görev üzerine kısa bir süre kurutun ve tarttı.
Bir süzgeç içine doku ve içeriğini dökümü ve el ile doku masaj için forceps kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokugramı başına 100%n-propanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın. Bir saat oda sıcaklığında karıştırın.
Sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Doku ve içeriğini 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın ve dokuya elle masaj yapmak için çalgılar kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokuyu gram doku başına 60 mililitre deiyonize su ile kaplayarak yıkayın.
15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru.
Dokuyu etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir gecede negatif 80 derecede donun. İlk olarak, sıvı nitrojen ile sığ bir kap doldurun. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve her lyophilized MFP tartın.
Harç bir örnek yerleştirin, sıvı azot içinde harç tutmak için bir kriyojenik eldiven kullanın. Daha sonra, numuneyi frezelemek için el yapımı bir matkapla bağlı bir pestisit kullanın. İlerlemeyi kontrol etmek ve eldivenli eli sıvı nitrojenden çıkarmak için bir dakika aralıklarla değirmen.
Tüm numuneler için bu frezeleme işlemini tekrarlayın, her numune nin arasında harç ve havaneli etanol ile püskürttüğe ve silindiğinden emin olun. Toz numuneleri 15 mililitrelik tüplerde kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, dondurucudan örnekleri çıkarın ve oda sıcaklığında çözülün.
Numuneler çözülürken, pepsin'i hidroklorik aside karıştırarak Pepsin-HCL çözeltisi oluşturun. Sonra, 15 mililitrelik bir tüp için örnek toz ve Pepsin-HCL çözeltisi ekleyin, küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 48 saat karıştırın. Bundan sonra, beş dakika buz üzerinde tüpler yerleştirin.
Her numuneye 10X PBS ekleyin, böylece nihai çözelti 1X PBS konsantrasyonuna sahiptir. Daha sonra, her çözeltiyi ayrı ayrı test etmek için pH kağıt kullanarak pH 7.4'e ulaşmak için her çözeltiye %10 hacim/hacim, 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Bir pH 7.4 jel çözeltisi kullanarak, peletli GFP ve luciferase etiketli 4T1 hücrelerini mililitre başına 500, 000 veya 1, 000, 000 hücreli bir konsantrasyona geri alın.
16 kuyulu bir hazneslayt her kuyuya jel hücre çözeltisi 16 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Bundan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre tam RPMI ortamı ekleyin. 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Daha sonra, hücreleri 519 nanometre ve 618 nanometre emisyon dalga boyunda gözlemlemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, normal doku radyasyonu etkileri çalışılmıştır, ekstrasellüler matris hidrojeller kullanılarak. Hematoksilin ve eozin boyama decellularization onaylamak için kullanılır, çekirdekleri ve DNA diğer izleri kaybı yoluyla.
Yağ Kırmızı O boyama lipid içeriğini değerlendirmek ve bir dipasite morfolojisi tutma onaylamak için kullanılır iken. ECM hidrojellerinin reolojik özellikleri 37 santigrat derecede değerlendirilir. Depolama modülü tüm koşullar için kayıp modülünden daha yüksektir ve hidrojel oluşumunu gösterir.
GFP ve luciferase etiketli 4T1 meme karsinom hücreleri daha sonra hidrojellerde kapsüllenir. Hücre proliferasyonu floresan mikroskobu, illuminesans ölçümleri ve canlılık boyama ile, kapsülleme den 48 saat sonra incelenir. Işınlanmış hidrojeller tümör hücre çoğalmasında artan bir eğilim göstermektedir.
Phalloidin konjuge kapsüllü hücrelerde F-Actin görselleştirmek için kullanılır. Değirmen içine doku yerleştirmeden önce harç soğutmak için unutmayın, sıcak bir harç eksik frezeleme yol açabilir. N-propanal ve pepsin kullanırken dikkatli olun, sadece bir kimyasal başlık altında n-propanal ve diğer desellüler ajanlar açın.
Mümkünse, bir kimyasal başlık altında pepsin tartMak, teneffüs tehlikesi olduğu gibi. Işınlama ve hücreleşme sonrası ECM bileşimi değişiklikleri kütle spektrometresi ve Raman spektroskopisi ile değerlendirilebilir. Ayrıca ECM hidrojellerinin lif yapısı taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.
Bu yöntem, radyasyonun sadece tümör hücreleri değil, aynı zamanda bağışıklık hücreleri ve tedavi sonucunda radyasyon hasarı yaşayan dokular üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilme potansiyeline sahiptir. Bu decellularization tekniği araştırmacılar radyasyon aşağıdaki dokunun ekstrasellüler matriks özelliklerini değerlendirmek için izin verecektir, hangi çoğu kanserlerde önemli bir tedavi seçeneğidir.
