Ce protocole montre que le rayonnement influence les propriétés de matrice extracellulaire du tissu adipeux dans la graisse mammaire murine. L’ajout de rayonnement dans un modèle de décellularisation n’a jamais été fait auparavant. Cette technique utilise plusieurs étapes de lavage qui servent chacune un but chimique unique dans le processus de décellularisation.
La spécificité de cette technique permet des lavages chimiques plus doux, afin de mieux préserver les propriétés tissulaires. La rechute du cancer du sein survient après la thérapie, en particulier dans les cas triplement négatifs. L’évaluation de la façon dont la matrice extracellulaire irradié modifie le comportement des cellules tumorales mènera à des découvertes importantes sur les mécanismes de répétition.
Après avoir irradié des échantillons, à l’aide d’une source de césium, transférez les MFP irradiés et les supports RPMI complets dans une armoire de biosécurité. Remplissez les plats de six centimètres ou de 10 centimètres avec suffisamment de supports pour submerger les MFP. Incuber à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone, pendant deux jours.
Tout d’abord, placez les MFP dans des plats de six centimètres avec cinq millilitres de solution Trypsin-EDTA. Vaporiser et essuyer la vaisselle avec 70% d’éthanol et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Utilisez des passoires de 0,7 millilitre pour laver les MFP avec de l’eau déionisée, en versant de l’eau sur le tissu trois fois.
Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus entre les lavages. Ensuite, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le. Placer les tissus séchés dans un bécher pré-autoclavé, contenant une barre de remue-remuer de taille appropriée et couvrir les tissus de 60 millilitres de 3% t-octylphénoxypolyethoxyéthanol par gramme de tissu.
Remuer pendant une heure à température ambiante. Puis jetez le contenu du bécher dans une passoire. Rincer le bécher à l’eau déionisée et verser sur les tissus.
Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages. Après cela, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyer et peser. Remettre les tissus et les barres émottes dans les mêmes bechers et les couvrir de 60 millilitres d’acide désoxycholique à 4 % par gramme de tissu.
Remuer à température ambiante pendant une heure. Ensuite, jetez le contenu du bécher dans une passoire en maille, rincez le bécher avec de l’eau déionisée et versez-le sur les tissus. Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages.
Séchez brièvement le tissu rincé sur un chiffon de tâche délicat et pesez-le. Placez les tissus séchés dans le même bécher, avec de l’eau déionisée fraîche, complétée par 1% de pénicilline-streptomycine. Couvrir le bécher hermétiquement de film de paraffine et laisser à 4 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, égoutter le contenu du bécher dans une passoire, sécher brièvement le tissu sur un chiffon tâche délicate et le peser. Ensuite, placez les MFP dans le même bécher avec une barre d’agitation de taille appropriée. Couvrir le tissu de 60 millilitres d’une solution contenant 4 % d’éthanol et 0,1 % d’acide périacétique par gramme de tissu.
Remuer à température ambiante pendant deux heures. Jetez le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu et remettre le contenu dans le bécher.
Lavez le tissu en le couvrant de 60 millilitres de 1X PBS par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez tout ce processus de lavage une fois de plus.
Ensuite, videz le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. À l’aide de forceps, masser manuellement le tissu et remettre le contenu dans le bécher. Lavez le tissu en le couvrant de 60 millilitres d’eau déionisée par gramme de tissu.
Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez tout ce processus de lavage une fois de plus. Séchez brièvement le tissu lavé sur un chiffon de tâche délicat et pesez-le.
Jetez le tissu et le contenu dans une passoire et utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher et couvrir les tissus de 60 millilitres de 100% n-propanol par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le. Jetez le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 millimètre et utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher et laver les tissus en le couvrant de 60 millilitres d’eau déionisée par gramme de tissu.
Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez ce processus de lavage trois fois. Après cela, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le.
Transférer le tissu dans un tube étiqueté de 15 millilitres et congeler à 80 degrés Celsius négatif pendant la nuit. Tout d’abord, remplissez un récipient peu profond d’azote liquide. Retirez les échantillons du congélateur et pesez chaque MFP lyophilisé.
Placez un échantillon dans le mortier, utilisez un gant cryogénique pour maintenir le mortier dans l’azote liquide. Ensuite, utilisez un pilon, attaché à une perceuse à main, pour moudre l’échantillon. Moudre en intervalles d’une minute pour vérifier la progression et retirer la main gantée de l’azote liquide.
Répétez ce processus de fraisage pour tous les échantillons, en vous assurant de pulvériser et d’essuyer le mortier et le pilon avec de l’éthanol entre chaque échantillon. Conserver les échantillons en poudre dans des tubes de 15 millilitres à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Pour commencer, retirez les échantillons du congélateur et décongelez à température ambiante.
Pendant que les échantillons sont décongelés, mélanger la pepsine en acide chlorhydrique pour former une solution Pepsin-HCL. Ensuite, ajoutez de la poudre d’échantillon et la solution Pepsin-HCL à un tube de 15 millilitres, ajoutez une petite barre de remue-remuer et remuez pendant 48 heures. Après cela, placez les tubes sur la glace pendant cinq minutes.
Ajouter 10X PBS à chaque échantillon, de sorte que la solution finale a une concentration de 1X PBS. Ensuite, ajoutez 10% de volume/volume, 0,1 hydroxyde de sodium molaire à chaque solution, pour atteindre le pH 7.4, en utilisant du papier pH pour tester chaque solution individuellement. À l’aide d’une solution de gel pH 7.4, réutilisez les cellules granulées GFP et luciferase étiquetées 4T1 à une concentration de 500 000 ou 1 000 000 cellules par millilitre de solution gel.
Ajouter 16 microlitres de solution de cellules de gel à chaque puits d’une glissade de chambre de 16 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, ajouter 100 microlitres de supports RPMI complets à chaque puits. Continuer à couver à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence pour observer les cellules à une longueur d’onde excitation de 519 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 618 nanomètres. Dans cette étude, des effets normaux de rayonnement de tissu sont étudiés, utilisant des hydrogels extracellulaires de matrice. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine est utilisée pour confirmer la décellularisation, par la perte de noyaux et d’autres traces d’ADN.
Tandis que la coloration d’O rouge d’huile est employée pour évaluer la teneur en lipides et confirmer la conservation d’une morphologie de dipasite. Les propriétés rhéologiques des hydrogels ECM sont évaluées à 37 degrés Celsius. Le module de stockage est plus élevé que le module de perte pour toutes les conditions, démontrant la formation stable d’hydrogel.
Les cellules mammaires 4T1 de carcinome 4T1 sont ensuite encapsulées dans les hydrogels. La prolifération cellulaire est examinée par microscopie de fluorescence, par des mesures d’illuminescence et des taches de viabilité, 48 heures après l’encapsulation. Les hydrogels irradiés montrent une tendance croissante dans la prolifération de cellules de tumeur.
Phalloidin conjugué est utilisé pour visualiser F-Actin dans les cellules encapsulées. N’oubliez pas de refroidir le mortier avant de placer le tissu à l’intérieur du moulin, un mortier chaud peut conduire à un fraisage incomplet. Faire preuve de prudence lors de la manipulation de n-propanal et pepsine, seulement ouvert n-propanal et d’autres agents décellularisation sous une hotte chimique.
Si possible, peser la pepsine sous une hotte chimique, car il ya un danger d’inhalation. Les changements de composition de l’ECM après l’irradiation et la décellularisation peuvent être évalués à l’aide de la spectrométrie de masse et de la spectroscopie Raman. En outre, la structure fibreuse des hydrogels ECM peut être analysée par microscopie électronique à balayage.
Cette méthode a le potentiel d’être élargie pour examiner les effets du rayonnement sur, non seulement les cellules tumorales, mais aussi les cellules immunitaires, ainsi que les tissus qui éprouvent des dommages causés par la radiation, à la suite de la thérapie. Cette technique de décellularisation permettra aux chercheurs d’évaluer les propriétés extracellulaires de la matrice du tissu après le rayonnement, qui est une option de traitement importante dans la plupart des cancers.
