ברצוננו להודות למכון גולבנקיאן דה סינסיה (IGC) על שסיפק לנו גישה לחלק מהציוד הניסיוני המתואר בפרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 ולה Caixa HR17-00595 ל PMD ועל ידי מלגת מחקר עתידית של מועצת המחקר האוסטרלית (FT170100259) ל- CKM.

1. הכנת דיאטות סוכרוז-שמרים (SY)
<ol><li>שוקלים את כל החומרים היבשים (אגר, שמרים, סוכרוז) עבור איזון macronutrient ודיאטות גידול L3. הכמויות בגרמים עבור כל אחד מהמרכיבים הדרושים להכנת 1 L של מזון מסומנות באיור 1B. הערה: יש לקחת בחשבון כי כ 13 מ"ל של מזון יש צורך למלא צלחת פטרי 60 מ"מ.</li>
	<li>ממיסים את כל החומרים במים מזוקקים סטריליים (משתמשים בכ-50% מסך המים הדרוש להכנת המזון) ומערבבים את המדיום במשך 5-10 דקות.</li>
	<li>אוטוקלאב במשך 50 דקות.</li>
	<li>לאחר מתן אפשרות למדיומים להתקרר, מוסיפים פתרונות ניפגין וחומצה פרופונית לדיאטות, בריכוז סופי (v/v) של 3% ו-0.3%, בהתאמה. לדיאטות האיזון המקרונוטריאנטיות, הוסיפו צבע מאכל כחול לריכוז סופי (v/v) של 1%. להשלים את הנפחים הכוללים עם מים מזוקקים.</li>
	<li>יוצקים בזהירות את דיאטות המזון ל 60 מ"מ פטרי מנות, כך כמות המזון שפכו הוא בערך זהה בכל אחת הצלחות. תווית הצלחות עם יחסי P:C של הדיאטות. הערה: הכינו את דיאטות האיזון המקרונוטריינט ביום מבחני ההאכלה. אם לא ניתן, לאחסן את הדיאטות מוכנות ב 4 מעלות צלזיוס, במיכל אטום, למשך זמן מרבי של 3 ימים. תקופות אחסון ארוכות יותר הופכות את הדיאטה ליבשה וקשה מדי, והזחלים אינם יכולים להתחפר במדיום.</li>
</ol>2. צלב גנטי של קווי הורים
הערה: השתמש במערכת Gal4/UAS21 כדי להגדיר את הצלבים הגנטיים. בפרוטוקול זה, על מנת להפעיל את התפקוד העצבי באוכלוסיות עצביות ספציפיות, נעשה שימוש בתולות נקבות של קו UAS dTRPA117 וחצו לזכרים מקווי Janelia Gal4(איור 2A). הבקרה הגנטית בה נעשה שימוש הייתה צאצא של הכלאה בין קו dTRPA1 לבין קו "GAL4 ריק", הנושא את Gal4 בווקטור ששימש ליצירת אוסף רובין גל4 אך ללא שבר רגולטורי נוכח (attP2)22. כדי לקדם את הדיכוי העצבי, ניתן להשתמש בקידוד קו UAS ShibireTS20, במקום dTRPA1.
<ol><li>הגדר כלובי איסוף עוברים 60 מ"מ עם L3 גידול צלחות דיאטה, בתוספת כמה משחת שמרים פעילה.</li>
	<li>העבר את הבתולות הנשיות הבוגרות UAS dTRPA1 ואת זכרי Janelia Gal4, בני 5-8 ימים, לכלובי איסוף העוברים ואפשר להזדווגות להתרחש במשך 24-48 שעות, ב 25 °C (60°C), עם 60% לחות ומחזור 12:12 כהה בהיר(איור 2A). עבור כלובי איסוף עוברים 60 מ"מ, יש להשתמש בכ-100 נקבות בתולות וב-30 זכרים לכל צלב.</li>
	<li>בסוף תקופת ההזדווגות, להסיר ולהשליך את L3 גידול צלחות דיאטה המשמשים הצלבים הגנטיים. החליפו אותם בצלחות דיאטה טריות לגידול L3, על מנת לבצע את מטילי הביצים ואת בימוי הזחל.</li>
</ol>3. הכנת זחלים כוכב שלישי (L3)
<ol><li>מעבירים את הזבובים הבוגרים ההזדווגות לצלחות דיאטה טריות לגידול L3 ומאפשרים להטלת הביצים להתרחש למשך 3-4 שעות, ב-25°C(איור 2B). ודא כי כל הצלחות מסומנות עם הגנוטיפ, יחס P:C של הדיאטה ואת התאריך של מטיל ביצה. הערה: כדי לחסוך זמן, לבצע את הטלת הביצים ישירות לתוך דיאטה גידול L3, אשר נמנע טיפול נוסף של הביצים. במקרה של הקרנות גנטיות בקנה מידה קטן, אופטימיזציה של הטלת הביצים ניתן להשיג באמצעות צלחות אגר מיץ תפוחים.</li>
	<li>בסוף תקופת הטלת הביצים, מוציאים את הצלחות מהכלובים ומכסים אותן במכסי פלסטיק. במקרה תמצית שמרים משמש כדי להשלים את צלחות גידול L3, הקפד להסיר את כל השמרים שיורית בסוף הטלת הביצה. זה חשוב כדי למנוע האכלה לא אחידה במהלך צמיחת הזחל. הערה: ניתן להעביר את המבוגרים ההזדווגות לצלחות דיאטה טריות לגידול L3, כך שיותר מטילי ביצים מבוצעים, וניתן להשיג זחלים ניסיוניים יותר. מטילי ביצים רצופים יכולים להתבצע עם אותם מבוגרים במהלך שבוע עבודה שלם.</li>
	<li>להעריך את מספר הביצים לכל צלחת ולשמור על צפיפות הזחל למקסימום של 200 עוברים לכל צלחת. הערכה זו יכולה להיעשות על ידי ספירת מספר העוברים ברבע מהצלחת. הערה: צלחת צפופה תעכב את התפתחות הזחל ותשפיע על התנהגויות האכלת הזחלים.</li>
	<li>דגירה L3 צלחות גידול ב 18 °C (טמפרטורה מתירנית), 60% לחות מחזור 12:12 כהה בהיר, ולאפשר הזחלים לגדול במשך 9 ימים (איור 2B).</li>
	<li>ביום התשיעי לאחר הטלת הביצים (AEL), לאסוף שלוש קבוצות של 10 L3 מכל אחד הגנוטיפים (ועבור שכפולים) להיבדק. בנוסף, לאסוף קבוצות של 10 L3 עבור בקרת "מזון אפס צבע". ודא כי אוסף הזחלים נעשה בתקופות זמן שוות ערך של היום המשמש לביצוע הטלת הביצית (למשל, אם הטלת הביצים התרחשה בין השעות 10:00-14:00, לאסוף את הזחלים במהלך אותה תקופה של זמן 9 ימים AEL) והוא מבוצע, בעדינות רבה ככל האפשר, באמצעות מלקחיים #5 או מלקחיים במשקל נוצה. העבר ישירות את הזחלים כפי שצוין בשלב הבא (3.6). הערה: בעלי החיים השולטים ב"מזון ללא צבע אפס" הם זחלים שבמהלך מבחני ההאכלה מקבלים מזון ללא צבע כחול. פקד זה הוא הכרחי כדי להסיר את ספיגת הרקע של תמציות הזחל.</li>
	<li>מעבירים את הזחלים הניסיוניים שנאספו לסירות פלסטיק במשקל צלחת המכילות 1 מ"ל מים. ודאו ש-L3 נאסף, ולא L2, על-ידי ביצוע ההוראות המופיעות באיור 3. הערה: האוסף של L3 לסירות פלסטיק המכילות מים או מלוחים 1x פוספט אגירה (PBS), חשוב לשמור על זחלים hydrated היטב לפני תחילת מבחני האכלה. זה חשוב במיוחד אם מספר קבוצות L3 ניסיוניות מגנוטיפים שונים נאספים בו זמנית. עקוב אחר סדר הגבייה עבור כל קבוצה, כך שההבדלים במשך מניעת המזון עבור כל קבוצה ממוזערים. השימוש בסירות פלסטיק בשלב זה מקל על השלב האופציונלי 4.3 כפי שהוא מאפשר זחלים לצוף ישירות לתוך אמבט המים.</li>
</ol>4. הפעלה תרמוגנטית ומזינה ללא ברירה
הערה: מומלץ לבצע את מבחני ההאכלה בערך באותו זמן של היום כדי למזער וריאציות אפשריות הקשורות למקצבים הביולוגיים. כמו כן, תמיד להפעיל את ניסויי הבקרה (הצאצאים של הקו "Gal4 ריק" חצה UAS dTRPA1 ואת "אפס צבע מזון" זחלים), במקביל הגנוטיפים של עניין.
<ol><li>הגדר חממה ל 30 °C (טמפרטורה לא מתירנית) ולשמור על רמות גבוהות של לחות (לפחות 65%) כדי למנוע התייבשות זחל במהלך ההסתעפות.</li>
	<li>לפני תחילת מבחני ההאכלה, יש לאיית את טמפרטורת לוחות ההזנה על ידי חימום שלהם ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>(אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' מחממים את הזחלים הניסיוניים במשך 2 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בצע שלב זה עם בעלי החיים בסירות משקל פלסטיק המכיל קצת מים. הערה: מטרת צעד זה היא להגביר את ההפעלה העצבית על ידי קידום הירי של הנוירונים מאז תחילת מבחני ההאכלה.</li>
	<li>שמור על טיימרים מרובים מוכנים למשך שעה אחת. מספר הטיימרים לשימוש תלוי במספר קבוצות הניסוי הנבדקות וברמת המיומנות של הנסיין בטיפול בזחלים. הערה: השימוש בעוקבי זמן מרובים הוא קריטי כדי לשמור על משך הזמן של הבוחן עקבי עבור כל הגנוטיפים.</li>
	<li>מסננים בזהירות את המים מסירות הפלסטיק, ובאמצעות מברשת רכה ולחה, מעבירים בעדינות את קבוצות L3 מהסירות למרכז לוחות ההסעה. מחזירים את מכסי הצלחות ומתחילים טיימר לכל צלחת (או קבוצת צלחות) כדי לשמור על מפגשי הזנה מדויקים של שעה.</li>
	<li>אפשר לזחלים להזין במשך שעה, ב-30°C, בחושך(איור 2C). הערה: הביצועים של ההסמכה בחושך חשוב לשלוט על הבדלים רמזים חזותיים על פני דיאטות, כמו דיאטות יהיו שונים בגוונים, למרות שהם מכילים את אותו ריכוז צבע.</li>
	<li>לעצור את מבחני האכלה על ידי העברת הצלחות לאמבט קרח. לחץ על הקרח ככל האפשר כדי לספק משטח יציב עבור הצלחות. הערה: טמפרטורות קרות יקדמו את סוף ההאכלה על ידי עיכוב התנהגויות חפירה וחפירה. רוב הזחלים יעלו על צלחות המזון לאחר מספר דקות, ויקלו על החלמתם בשלבים הבאים.</li>
</ol>5. מיצוי צבע מזון
<ol><li>הכן 2 microtubes מ"ל עבור כל קבוצה של 10 L3 נבדק, המכיל בערך את אותן כמויות של חרוזים זכוכית 0.5 מ"מ (מספיק כדי למלא את החלק התחתון של microtube) ו 300 μL של מתנול קר כקרח. שמור את microtubes בקור, באמצעות צידנית ספסל. התראה: מתנול הוא מאוד דליק ורעיל. בצע את כל נהלי הבטיחות המומלצים לטיפול מגיב זה, כולל עבודה באזור מאוורר היטב ללבוש כפפות ניטריל. הערה: השימוש במתנול חשוב כדי לתקן את דגימות הזחל ולהימנע מתגובות מלניזציה בקוטיקל.</li>
	<li>באמצעות #5 או מלקחיים במשקל נוצה, לשחזר בזהירות את הקבוצות של 10 L3 מלוחות מבחני האכלה ולהעביר אותם למכסים של לוחות ההסמכה המכילים קצת מים. יש לשטוף את הזחלים כדי להסיר פסולת מזון על גופם תוך טיפול עדין בזחלים כדי למנוע פציעות. שמור תיעוד של מספר הזחלים שנמצאו עבור כל גנוטיפ לכל שכפול, כך שניתן לכמת את הכמות הממוצעת של צריכת מזון לכל זחל. הערה: זחלים פצועים צריכים להיות מושלכים כפי שהם יהיו קוטיקל מלני, להיות מתאים לכימות צבעוני.</li>
	<li>העבר את קבוצות L3 למיקרו-צינורות 2 מ"ל שהוכנו ב-5.1.</li>
	<li>Lyse את רקמות הזחל כדי לחלץ את צבע המזון מהמעיים על ידי שיטת תמוגה מכנית באמצעות ליזר רקמה חרוזי זכוכית הוסיף בשלב 5.1. (אם ליזר רקמה אינו זמין, השתמש עלה הומוגניזציה). באופן מועדף, בצע שלב זה ב- 4 °C(איור 2D). הערה: משך שלב זה יהיה תלוי בציוד שבו נעשה שימוש. באמצעות ליצר רקמה קונבנציונלי, 1 דקות החילוץ מספיק. במקרה של התכווצות זמן, ניתן להשהות את הפרוטוקול בסוף שלב זה ולהמשיך מאוחר יותר. אחסן את הדגימות ב- -20 °C (69 °F).</li>
	<li>להעביר את התמציות כדי לנקות 1.5 מ"ל microtubes, על ידי היפוך ישיר של 2 microtubes 2 מ"ל על microtubes 1.5 מ"ל החדש. אם מבוצע בעדינות, רוב חרוזי הזכוכית יישארו בתחתית microtube 2 מ"ל.</li>
	<li>לנקות את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה תמציות, במהירות מקסימלית במשך 10 דקות, ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את supernatants לנקות 1.5 microtubes מ"ל. אם פסולת תאית עדיין גלויה ב supernatants, לחזור על שלבים 5.6 ו 5.7.</li>
</ol>6. כימות צבעוני של צריכת המזון
<ol><li>הכן פתרונות סטנדרטיים, כדי ליצור עקומת כיול, על-ידי ביצוע דילול טורי של 1:2 במתנול של פתרון צבע כחול מתחיל. כריק, השתמש במתנול בלבד. ריכוז התקנים תלוי ברמות צריכת המזון של בעלי החיים. הערה: במקרה של מסך הפיילוט המוצג כאן, כמו ריכוזי הצבע שהושגו עבור תמציות הזחל נע בין 0.02 ל 1.93 μL / mL, זה שימש עקומה סטנדרטית המתקבלת על ידי מדידת הספיגות של 8 דילול סדרתי של פתרון 2 μL / mL כחול צבע במתנול. במידת הצורך, להגדיל או להקטין את הריכוז של פתרונות אלה, בהתאם לריכוז הצבע של דגימות הניסוי.</li>
	<li>העבר 100 μL של דגימות הניסוי (המתקבלות בשלב 5.7), תקנים וריקים (שלב 6.1) לבארות של מיקרופלאט 96 בארות ומדוד את הספיגה ב- 600 ננומטר, באמצעות קורא לוחות (איור 2E). כדי להסיר את ספיגת הרקע, למדוד את ספיגת תמציות המתקבל זחלים מוזנים על מזון ללא צבע כחול כמו "אפס" עבור תמציות הזחל ("אפס צבע בקרת מזון).</li>
	<li>צור עקומה סטנדרטית ותאם את ערכי הספיגה המתקבלים עבור הדגימות מכל קבוצת זחל ניסיונית עם כמות צריכת המזון (נפח ב- mL). מצא את צריכת המזון הממוצעת לכל זחל על ידי התחשבות במספר הזחלים שנאספו עבור כל קבוצה בשלב 5.2</li>
</ol>

<ol>
	<li>Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature of nutrition - a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).</li><li>Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+morphology+with+behavior+during+development:+an+integrative+approach+from+a+fly+perspective.">Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).</li><li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+amino+acid+state+modulates+yeast+taste+neurons+to+support+protein+homeostasis+in+Drosophila.">Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila.</a> Elife. 7, 31625 (2018).</li><li>Itskov, P. M., Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dilemmas+of+the+gourmet+fly:+the+molecular+and+neuronal+mechanisms+of+feeding+and+nutrient+decision+making+in+Drosophila.">The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila.</a> Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).</li><li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila.">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li><li>Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+imbalance+explains+extension+of+lifespan+by+dietary+restriction+in+Drosophila.">Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila.</a> Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila:+New+insights+from+nutritional+geometry.">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).</li><li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+protein+intake+is+associated+with+a+major+reduction+in+IGF-1,+cancer,+and+overall+mortality+in+the+65+and+younger+but+not+older+population.">Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).</li><li>Solon-Biet, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+macronutrients,+not+caloric+intake,+dictates+cardiometabolic+health,+aging,+and+longevity+in+ad+libitum-fed+mice.">The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).</li><li>Piper, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster.">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li><li>Jones, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+reach+of+the+GAL4/UAS+system+into+the+behavioral+neurobiology+of+Drosophila.">The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila.</a> BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).</li><li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit.">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).</li><li>Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+drug+screening+in+Drosophila+identifies+the+5HT2A+receptor+as+a+feeding+modulation+target.">Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target.</a> Scientific Reports. 3, (2013).</li><li>Schoofs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+motor+programs+for+suppressing+food+intake+and+inducing+locomotion+in+the+Drosophila+brain.">Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain.</a> PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).</li><li>Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+diet+matter?+The+roles+of+larval+and+adult+nutrition+in+regulating+adult+size+traits+in+Drosophila+melanogaster.">When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology.">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+of+Drosophila+courtship+song.">Motor control of Drosophila courtship song.</a> Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).</li><li>Mirth, C. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+intake+and+food+choice+are+altered+by+the+developmental+transition+at+critical+weight+in+Drosophila+melanogaster.">Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).</li><li>Simpson, S. J., Raubenheimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+the+protein+leverage+hypothesis.">Obesity: the protein leverage hypothesis.</a> Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).</li><li>Raubenheimer, D., Simpson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+models+of+nutrient+balancing:+application+to+insects+and+vertebrates.">Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates.</a> Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).</li><li>Li, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila.">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).</li><li>Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila.">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).</li><li>Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+measuring+feeding+rate+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).</li><li>Almeida-Carvalho, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם פרוטוקול זה, ניתן לבדוק את היכולת של זחלים תחת התרמוגנטית-הפעלה של אוכלוסיות עצביות ספציפיות כדי לווסת את רמות צריכת החלבון והפחמימות, שני macronutrients העיקריים, כאשר נחשפים דיאטות של הרכב P:C שונים. שיטה זו נבדקה בהקשר של הקרנה ראשונית של הזחל שמטרתה לזהות אוכלוסיות עצביות הקשורות לשליטה בצ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1&#160;was updated from:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" /> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

כל בעלי החיים תלויים בתנור תזונה מאוזנת כדי לרכוש את הכמויות הדרושות של חומרים מזינים להישרדות, צמיחה, רבייה1. הבחירה של מה וכמה לאכול מושפעת ממספר רב של גורמים אינטראקציה הקשורים למצב הפנימי של החיה, כמו רמת השובע, ותנאים סביבתיים, כגון איכות המזון2,3,4,5. חלבונים ופחמימות הם שני מקרונוטריאנטים עיקריים והצריכה המאוזנת שלה חיונית כדי לקיים תהליכים פיזיולוגיים של בעלי חיים. לכן, ההבנה של המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגויות האכלה ושמירה על צריכה מאוזנת של מקרונוטריאנטים אלה רלוונטית ביותר. הסיבה לכך היא שתכונות היסטוריית החיים כמו תוחלת חיים, פוריות ובריאות מטבולית מושפעות ישירות מרמות צריכת החלבון6,7,8,9,10.
השימוש באורגניזמים פשוטים יותר הניתנים למתיחה, המציגים הרגלי האכלה שמורים מבחינה אבולוציונית עם בעלי חיים מורכבים, כולל יונקים, חיוני למחקרים מסוג זה. חשוב לציין, מודלים פשוטים אלה של בעלי חיים מספקים הזדמנות טובה לנתח שאלות ביולוגיות מורכבות בהקשר יקר, אתי ויעיל יותר מבחינה טכנית. בעשורים האחרונים, Drosophila, עם ערכת הכלים הגנטית רבת העוצמה שלה, התנהגות מורכבת וסטריאוטיפית וארכיטקטורה שמורה של מנגנוני חישה היקפיים וחומרים מזינים עם יונקים, היה מודל פורה לנוירוביולוגים התנהגותיים11. בסופו של דבר, התקווה היא כי על ידי הבנת איך צריכת המזון מוסדר בבעלי חיים אלה, עם מערכת עצבים פשוטה יותר, אז אנחנו יכולים להתחיל להתיר תקלות עצביות ביסוד הפרעות אכילה אנושיות.
המחקר של מצעים עצביים להתנהגויות האכלה תלוי עמוק ביכולת למדוד בו זמנית את צריכת המזון של בעלי חיים תוך מניפולציה של הפעילות העצבית שלהם. בשל כמויות המזון המינימליות שנבלעו, כימות כמות המזון הנאכלת על ידי זבובים הוא מאתגר ביותר, וכל השיטות הזמינות כיום מציבות מגבלות משמעותיות. לכן, תקן הזהב הוא להשתמש בשילוב של מתודולוגיות משלימות12. זבובים בוגרים זכו להעדפה היסטורית כמודל גנטי והתנהגותי. אף על פי כן, זחלים Drosophila, גם להציע הזדמנויות לחקור מצעים עצביים קידוד התנהגות האכלה. מערכת העצבים המרכזית הזחל (CNS), עם כ 12,000 נוירונים, הוא משמעותית פחות מורכב מזה של המבוגר, אשר מכיל כ 150,000 נוירונים. מורכבות נמוכה זו היא לא רק מספרית אלא גם פונקציונלית, שכן התנהגויות הזחל מסתמכות על פונקציות קטר פשוטות יותר ומערכות חושיות. למרות הפשטות לכאורה של מערכות העצבים שלהם, זחלים עדיין להפגין התנהגויות האכלה מלאה, וכמה שיטות לכמת בליעה מזון בזחלים Drosophila תוארו5,13,14,15. על ידי זיווג עם מניפולציות של פעילות עצבית, זחלים Drosophila יכול להוות מודל מאוד נוח להבנת הרגולציה העצבית של צריכת המזון.
בתנאי שלהלן פרוטוקול מפורט לכימות צריכת המזון בזחלים החשופים לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. הדיאטות, מה שמכונה דיאטות איזון macronutrient, היו שונות בתכולת החלבון והפחמימות, במיוחד ביחס בין החלבון לפחמימות (P:C): 1:1 (תזונה עשירה בחלבון), 1:4 (דיאטת ביניים) ו- 1:16 (תזונה לקויה בחלבון), כפי שמוצג באיור 1A. בקצרה, בדיקה כמותית ללא ברירה האכלה הוקמה באמצעות אלה שלוש דיאטות סוכרוז-שמרים isocaloric (SY)מבוסס צבוע עם צבע מזון כחול. מכיוון שתמצית שמרים וסוקרוז שימשו כמקורות חלבון ופחמימות, ושניהם מכילים פחמימות, השונות ביחסי P:C הושגה על ידי שינוי האיזון בין שני מרכיבים אלה, כפי שתואר קודם לכן16 וכפי שצוין באיור 1B. סקירה סכמטית של הפרוטוקול, המציגה את שלבי הניסוי העיקריים, זמינה באיור 2.
פרוטוקול זה הוקם במטרה לחקור את תפקידן של אוכלוסיות עצביות ספציפיות על ויסות רמות האכלת הזחלים בדיאטות של יחסי P:C שונים ובהקשר של מסך עצבי תרמוגנטי. כלי נוירוגנטי מאופיין היטב שימש ממשפחת פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP): Drosophila חולף קולטן פוטנציאל ערוץ (dTRPA1), שהוא ערוץ קטיון טמפרטורה ומתח מגודר, המאפשר ירי של פוטנציאל פעולה כאשר טמפרטורות הסביבה לעלות מעל 25 °C17. כדי לבטא את טרנסג'ין dTRPA1, ניצלנו את קווי Gal4 המבוססים על אזורים רגולטורייםמן הגנום Drosophila, שהוקם במעבדת רובין, בהקשר של פרויקט FlyLight בקמפוס המחקר Janelia18,19.
למרות הפרוטוקול, כאן מתואר, נקבע בהקשר של מסך הפעלה, זה יכול להיות מותאם בקלות על ידי הנסיין לצרכים ספציפיים אחרים או תחומי עניין, כלומר לבצע מסך דיכוי באמצעות משתיק עצבים רגיש לטמפרטורה ShibireTS20, חלופה dTRPA1. התאמה זו והסתגלויות אחרות נידונות בסעיפי הפרוטוקול והדיון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2112px;" width="2113">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">1.5 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.690.001</td>
			<td style="width:1272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10xPBS</td>
			<td style="width:271px;">Nytech</td>
			<td style="width:247px;">MB18201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2.0 mL microtubes</td>
			<td style="width:271px;">Sarstedt AG &#38; Co.</td>
			<td style="width:247px;">72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Greiner Bio-one, Austria</td>
			<td style="width:247px;">628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96 well microplates</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-204453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agar</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bench cooler</td>
			<td style="width:271px;">Nalgene, USA</td>
			<td style="width:247px;">Labtop Cooler 5115-0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Blue food dye</td>
			<td style="width:271px;">Rayner, Billingshurst, UK</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell disruption media</td>
			<td style="width:271px;">Scientific Industries, Inc.</td>
			<td style="width:247px;">888-850-6208</td>
			<td>(0.5 mm glass beads)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dish weight boats</td>
			<td style="width:271px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:247px;">SC-201606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td>
			<td style="width:271px;">Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td style="width:247px;">FLY1212 (59-100)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:271px;">BioQuip Products, USA</td>
			<td style="width:247px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fly food for stocks maintenance</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Forceps #5</td>
			<td style="width:271px;">Dumont</td>
			<td style="width:247px;">0108-5-PS</td>
			<td>Standard tips, INOX, 11cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">LMS Ltd, UK</td>
			<td style="width:247px;">Series 2, Model 230</td>
			<td>For thermogenetic feeding assay (30&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Incubator</td>
			<td style="width:271px;">Percival Scientific, USA</td>
			<td style="width:247px;">DR36NL</td>
			<td>To stage larvae (19&#8728;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Janelia lines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Detailed information in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Macronutrient balancing diets</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Methanol</td>
			<td style="width:271px;">VWR</td>
			<td style="width:247px;">CAS number: 67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:271px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:247px;">H5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:271px;">VWR, USA</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:271px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:247px;">5804 R / Serial number: 5805CI364293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Rubin Gal4 ines</td>
			<td style="width:271px;">Janelia Research Campus</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ShibireTS UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 66600</td>
			<td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Soft brushes</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>For sorting anaesthetised fruit flies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Spectrophotometer plate reader</td>
			<td style="width:271px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:247px;">Multiskan Go 51119300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:271px;">Nikon</td>
			<td style="width:247px;">1016625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sucrose</td>
			<td style="width:271px;">Sidul, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Third-instar larvae (L3) rearing diet</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>Composition and nutritional information in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Timer</td>
			<td style="width:271px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tissue lyzer / bead beater</td>
			<td style="width:271px;">MP Biomedicals, USA</td>
			<td style="width:247px;">FastPrep-24 6004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TRPA1 UAS line</td>
			<td style="width:271px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:247px;">BDSC number: 26264</td>
			<td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 &#8728;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath</td>
			<td style="width:271px;">Sheldon Manufacturing Inc., USA</td>
			<td style="width:247px;">W20M-2 / 03068308 / 9021195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:271px;">Pr&#243;-vida, Portugal</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

התנהגויות ליקוט והאכלה מאפשרות לבעלי חיים לגשת למקורות אנרגיה וחומרים מזינים החיוניים להתפתחותם, לבריאותם ולכשירותם. חקירת הרגולציה העצבית של התנהגויות אלה חיונית להבנת המנגנונים הפיזיולוגיים והמולקולריים שבבסיס הומאוסטזיס תזונתי. השימוש במודלים גנטיים של בעלי חיים כגון תולעים, זבובים ודגים מקל מאוד על מחקרים מסוג זה. בעשור האחרון, זבוב הפירות Drosophila melanogaster שימש כמודל בעל חיים רב עוצמה על ידי נוירוביולוגים החוקרים את השליטה העצבית של התנהגויות האכלה וליקוט. אמנם ללא ספק בעל ערך, רוב המחקרים בוחנים זבובים בוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המנצל את מערכת העצבים הזחלית הפשוטה יותר כדי לחקור מצעים עצביים השולטים בהתנהגויות האכלה כאשר הזחלים נחשפים לדיאטות שונות בתכולת החלבון והפחמימות שלהם. השיטות שלנו מבוססות על בדיקת האכלה כמותית של צבעים ללא ברירה, המבוצעת בהקשר של מסך הפעלה תרמוגנטית עצבית. כקריאה, כמות המזון שנאכל על ידי זחלים על פני מרווח זמן של 1 שעות שימשה כאשר נחשפה לאחת משלוש דיאטות עם תווית צבע השונות בחלבון שלהם ליחסי פחמימות (P:C). היעילות של פרוטוקול זה מודגמת בהקשר של מסך נוירוגנטי בזחל Drosophila, על ידי זיהוי אוכלוסיות עצביות מועמד המסדיר את כמות המזון שנאכל דיאטות באיכות macronutrient שונים. הצלחנו גם לסווג ולקבץ את הגנוטיפים שנבדקו לשיעורי פנוטיפים. מלבד סקירה קצרה של השיטות הזמינות כיום בספרות, היתרונות והמגבלות של שיטות אלה נדונים, כמו כן, כמה הצעות ניתנות על איך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לניסויים ספציפיים אחרים.

זחלי דרוזופילה מווסתים את צריכת החלבון שלהם במחיר בליעת פחמימות עודפות23 (עלילה סכמטית באיור 2E). למעשה, תעדוף זה של צריכת חלבון נצפתה בבעלי חיים רבים אחרים והוא נקרא מינוף החלבון24,25.
תוך ניצול התגובה ההתנהגות?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae at JoVE.com

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K Views.  Monash University. להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

Video: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection לזווג ו Assay Electrophysiology למסך עבור bioactivity של תרכובות באמצעות תסיסנית melanogaster סיבים הענק מערכת

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...