שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום immunometabolism על תרומתם של תאים חיסוניים לדלקת הנגרמת על ידי השמנת יתר בשומן ו steatohepatitis ברקמת הכבד. טכניקות אלה כבר אופטימיזציה לבידוד של שומן ותאי החיסון הכבד במודל דיאטה המושרה של steatohepatitis nonalcoholic מושגת באמצעות דיור מכרסמים ללא פתוגן לא ספציפי. שיטות אלה יכולות לסייע להעמיק את הבנתנו את המנגנונים האימונולוגיים המעורבים בתחזוקת הונוסטזיס מטבולי.
בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו למקסם את התשואה של תאים דיסוציאציה בת קיימא מבחינה תפקודית והגדרת gating הנכון בציטומטריה זרימה. כדי ליצור רקמת שומן מתלה חד-תאי, לרסס את החזה של עכבר המתת דם עם 70%אתנול, בזהירות לעשות חתך מרכזי חמישה עד שישה סנטימטרים דרך ההטנוזה וקיר הבטן לאורך כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל pleural ואת הלב. באמצעות מחט 26-מד, להזריק לפחות 10 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% לתוך הגידור השמאלי, ולהשתמש מספריים כדי לפתוח את חלל צפדית.
לאחר מכן, לנתח את רקמת השומן האפיגונדהאלית, ולשקול אותו. ניתוב מכני של רקמת השומן לחתיכות דקות בצלחת פטרי בארבע מעלות צלזיוס לפני העברת שברי הרקמה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. יש לשטוף את צלחת פטרי במיליליטר אחד של 0.5% אלבומין סרום בקר, או BSA, ב-PBS, ולהוסיף לצינור שלושה מיליליטר של רקמת שומן טרייה.
לאחר 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים בדקה, הוסיפו 5 מיליליטר של 0.5% BSA ב-PBS, וה מניחים את תקציר הפתיל על קרח. יש לאתר את הפתרון מספר פעמים באמצעות פיפט סרולוגי של 10 מיליליטר, ולהשתמש בבוכנה כדי להעביר את הפתרון דרך מסננת של 100 מיקרומטר. להפריד את שברי הרקמה על ידי צנטריפוגה, ולהשתמש פיפטה כדי להשליך את שבר adipocyte צף.
תן מחדש את גלולת תא שבר כלי הדם סטרומה במיליליטר אחד של אמוניום-כלוריד-אשלגן, או ACK, חיץ תזה, לעצור את תגובת ת ליסיס עם 10 מיליליטר של 2% נסיוב עגל עוברי, או FCS, ב PBS לאחר כמה שניות. לאחר מכן, לאסוף את תאי הדם הלבנים מבודדים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend גלולה ב 250 microliters של 2% FCS ב PBS לספירה. לקצור את הכבד לתוך צינור חרוט של PBS על קרח לפני השימוש בולים מזרק כדי לנטרל מכנית את הרקמה בצלחת פטרי בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את שברי רקמת הכבד המנותח לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תקציר כבד חם, ושטיפת צלחת פטרי עם שלושה מיליליטר של פתרון עיכול כבד טרי. לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה, לעצור את העיכול עם 20 מיליליטר של HBSS, ו triturate תרחיף הרקמה מספר פעמים עם פיפט סרולוגי 10 מיליליטר. השתמש בוכנה כדי להעביר את פתרון הרקמה דרך מסננת 100 מיקרומטר, ולאסוף את תאי הכבד על ידי צנטריפוגה.
תן שימוש חוזר את גלולה ב 20 מיליליטר של HBSS טרי, ולהסיר את מטריצת hepatocyte על ידי צנטריפוגה. לאסוף את supernatant עבור צנטריפוגה, resuspending את גלולה ב 10 מיליליטר של 33% צפיפות צמיגות נמוכה פתרון בינוני שיפוע ב- HBSS. להפריד את תאי החיסון בכבד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, ו resuspend גלולת לויקוציט במיליליטר אחד של חיץ תמוגה ACK.
לאחר ארבע דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את תמוגה עם 10 מיליליטר של HBSS, ולסנן את התאים דרך מסננת נקבובית 30 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה ב 250 microliters של 2%FCS ב PBS לספירה. לניתוח ציטומטרי זרימה של אוכלוסיות לויקוציט מבודדות, להוסיף עד שלוש פעמים 10 לשישה תאים ב 100 microliters של 2%FCS ב PBS מן הרקמה של עניין לתוך מיון תאים בודדים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות פוליסטירן, או FACS, צינורות.
הוסף 10 microliters של נוגדן נגד CD16/CD32 לכל צינור כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית במשך 10 דקות על קרח, ואחריו כתמים עם הנפח המתאים של תערובת נוגדנים מיקרוליטר אחד של צבע הכדאיות לכל מדגם כדי לאפשר אפליה חיה ומתה של תאים. לאחר 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור, לשטוף את הדגימות פעמיים עם שני מיליליטר של 2% FCS בתוספת PBS לשטוף, וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה PBS טרי בתוספת FCS.
כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, השתמש בדגימת בקרה שלילית לא מזוהמת כדי להגדיר את פיזור קדימה וצד, ולהתאים את המתחים של ציטומטר הזרימה כדי לזהות את אוכלוסיית לויקוציט קיימא ולא לכלול את הפסולת. לאחר מכן, הפעל דגימות בקרה מוכתמות בודדות לפיצוי צבעוני לפני הפעלת הדגימות הניסיוניות, איסוף לפחות חמש פעמים 10 לארבעת האירועים לכל צינור. לאחר מכן, לייצא את קבצי הנתונים FCS לניתוח, ולהגדיר את אסטרטגיית gating עבור לויוציטים חיוביים CD45 כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות תא החיסון הבאים של עניין.
כאן, מוצגת אסטרטגיית גת מייצגת עבור תת-תפוסות של תאי T, כולל אפליה כפולה וכתמי כדאיות בשומן פריגונאדל מורין. לוקוציטים חיוביים ל-CD45 מגודרים תחילה עבור CD4 ו- CD8 ולאחר מכן עבור ליגנד CD44 ו- CD62 כדי להפלות בין תאים נאיביים, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטר ותאי T של אפקט. תאים חיוביים CD44 מאופיינים עוד יותר עם CD127, תא רוצח כמו Lectin קולטן G1, ומוות מתוכנת-1.
כאן מוצגת אסטרטגיית הגט לניתוח תאי B, גרנולוציטים, תאים קטלניים טבעיים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים. אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים CD4-חיובי ו-CD8 זיכרון אפקטים חיוביים ניתן לזהות בעכברים דיאטה עתירת שומן שוכנים בתנאים שאינם SPF, ואילו תאי CD4 חיובי ו- CD8 חיוביים INTRAHEPATIC נמצאים נמוכים משמעותית בבעלי חיים אלה בהשוואה לעכברי דיאטה עתירי שומן SPF בשבוע השביעי. סטאטוזיס חמור, כולל עלייה של טיפות שומנים גדולים וכתוצאה מכך סיטטוזיס מקרו-וסקולרי, דלקת lobular, בלון hepatocellular, ומבנה lobular נהרס נמצא בעכברים חשופים דיאטה עתירת שומן בעוד רק כמה עכברי SPF להציג הצטברות שומן קלה בכבד.
בנוסף, אחוז התאים הרוצח הטבעי גבוה יותר ברקמת השומן perigonadal של עכברים חשופים דיאטה עתירת שומן, ואילו עכברי SPF דיאטה עתירת שומן הפגינו אחוזים גבוהים יותר של תאים דנדריטיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור את התאים על קרח ובחושך אלא אם צוין אחרת. עכשיו אתה צריך הבנה טובה של איך להכין כראוי מתלים חד-תאיים וכיצד לבודד שומן מורין ורקמות הכבד לניסויים ציטומטריה זרימה.
