Bu yöntem, immünmetabolizma alanındaki immünmetabolizma alanındaki soruların yanıtlanarak, immün hücrelerin obeziteye bağlı inflamasyona katkısı ve karaciğer dokusunda steatohepatit yardımcı olabilir. Bu teknikler non-spesifik patojen içermeyen kemirgen muhafaza yoluyla elde edilen nonalkolik steatohepatit diyet kaynaklı bir model yağ ve hepatik bağışıklık hücrelerinin izolasyon uğrup için optimize edilmiştir. Bu yöntemler metabolik homeostazın bakımında rol oynayan immünolojik mekanizmaları anlamamızı derinleştirmeye yardımcı olabilir.
Genel olarak, bu teknik yeni bireyler işlevsel olarak canlı ayrıştırılmış hücrelerin verimini maksimize ve akış sitometri uygun gating kurma ile mücadele edecek. Bir yağ dokusu tek hücreli süspansiyon oluşturmak için,% 70 etanol ile ötenazi li bir farenin göğüs sprey, ve dikkatle plevral kavite ve kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca integument ve karın duvarı ile beş ila altı santimetre merkezi kesi yapmak. 26-gauge iğne kullanarak, sol ventrikül apeks içine% 0.9 tuzlu çözeltien az 10 mililitre enjekte ve periton boşluğu açmak için makas kullanın.
Sonra, epigonadal yağ dokusunu inceleyin ve tartın. Doku parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmadan önce, yağ dokusunu dört derece santigrat derecede bir Petri kabında ince parçalara ayırın. Petri kabını PBS'de %0,5 büyükbaş hayvan serum albumini veya BSA mililitresi ile durulayın ve tüpe yağ dokusunun gramı başına üç mililitre taze hazırlanmış yağ dokusu sindirimi çözeltisi ekleyin.
37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyon 20 dakika sonra, PBS 0.5% BSA beş mililitre ekleyin ve buz üzerinde yağ sindirimi yerleştirin. Çözeltiyi 10 mililitrelik serolojik pipetle birden fazla triturate ve 100 mikrometrelik bir süzgeçten çözeltiyi geçirmek için bir piston kullanın. Santrifüj ile doku fraksiyonları ayırın ve yüzen adiposit fraksiyonu atmak için bir pipet kullanın.
Birkaç saniye sonra PBS'de 10 mililitre fetal baldır serumu veya FCS ile lisis reaksiyonu durdurularak, bir mililitre amonyum-klorür-potasyum veya ACK,lysis tamponundaki stromal vasküler fraksiyon hücre peletini yeniden askıya alın. Sonra, santrifüj tarafından izole beyaz kan hücreleri toplamak ve sayma için PBS% 2 FCS 250 mikrolitre pelet resuspend. Dört santigrat derecede bir Petri kabındaki dokuyu mekanik olarak ayrıştırmak için şırınga pulları kullanmadan önce karaciğeri buz üzerinde konik bir PBS tüpüne toplayın.
Parçalanmış karaciğer dokusu parçalarını 10 mililitre sıcak karaciğer sindirim solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve Petri kabını üç mililitre taze karaciğer sindirim çözeltisi ile durulayın. 37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyon 20 dakika sonra, HBSS 20 mililitre ile sindirimi durdurmak ve 10 mililitreserological pipet ile doku bulamaç birden fazla kez triturate. 100 mikrometrelik bir süzgeç yoluyla doku çözeltisi geçmek için bir piston kullanın ve santrifüj ile karaciğer hücreleri toplamak.
Taze HBSS 20 mililitre pelet resuspend ve santrifüj ile hepatosit matris kaldırın. HBSS'de %33 düşük viskoziteli yoğunluk gradyan orta çözeltinin 10 mililitreiçinde peleti yeniden sulandırın. Yoğunluk gradyan santrifüj ile karaciğer bağışıklık hücrelerini ayırın ve ACK lysis tampon bir mililitre lökosit pelet resuspend.
Oda sıcaklığında dört dakika sonra, 10 mililitre HBSS ile lysis durdurun ve santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp içine 30 mikrometre gözenek süzgeci ile hücreleri filtre. Daha sonra, sayma için PBS% 2 FCS 250 mikrolitre pelet resuspend. İzole lökosit popülasyonlarının akış sitometrik analizi için, pbs'de %2 FCS'nin 100 mikrolitresinde altı hücreye üç kat 10'a kadar ekleyip, ilgi dokusundan bireysel polistiren floresan aktif hücre sıralamasına veya FACS, tüplere ekleyin.
Buz üzerinde 10 dakika boyunca spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engellemek için her tüpe 10 mikrolitre anti-CD16/CD32 antikor ekleyin, ardından canlı ve ölü hücre ayrımcılığına izin vermek için numune başına uygun hacimde antikor karışımı ve bir mikrolitre canlı boya ile boyama yapın. Işıktan korunan dört santigrat derecede 20 dakika sonra, numuneleri yıkama başına %2 FCS artı PBS'nin iki mililitresi ile iki kez yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Sonra, taze PBS artı FCS pelet resuspend.
Akış sitometrisi ile hücreleri analiz etmek için, ileri ve yan dağılım ayarlamak için lekelenmemiş bir negatif kontrol örneği kullanın ve geçerli lökosit popülasyonu tespit etmek ve enkaz hariç tutmak için akış sitometrevoltajlarını ayarlayın. Daha sonra, deney numunelerini çalıştırmadan önce çok renkli kompanzasyon için tek lekeli kontrol numuneleri çalıştırın ve tüp başına dört olaydan en az beş kat 10 toplayın. Daha sonra, analiz için FCS veri dosyalarını dışa aktarın ve sonraki bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak sağlayacak ŞEKILDE CD45-pozitif lökositler için gating stratejisini ayarlayın.
Burada, çift ayrımcılık ve rürin perigonadal yağda canlılık boyama dahil olmak üzere T hücre alt popülasyonları için temsili bir gating stratejisi gösterilmiştir. CD45-pozitif lökositler ilk cd4 ve CD8 için ve daha sonra CD44 ve CD62 ligand için naif, merkezi bellek, efektör bellek ve efektör T hücreleri arasında ayrım yapmak için kapılı. CD44-pozitif hücreler daha sonra CD127, öldürücü hücre lektin benzeri reseptör G1 ve programlanmış ölüm-1 ile karakterizedir.
Burada, B hücreleri, granülositler, doğal öldürücü hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreleri analiz etmek için gating stratejisi gösterilmiştir. SPF olmayan koşullarda bulunan yüksek yağlı diyet farelerde daha yüksek bir etkileyici bellek CD4-pozitif ve CD8-pozitif hücreler tespit edilebilirken, intrahepatik naif CD4-pozitif ve CD8-pozitif T hücrelerinin bu hayvanlarda spf yüksek yağlı diyet farelere göre yedi hafta daki yüksek yağlı diyet farelere göre oldukça düşük olduğu saptanmıştır. Makrovesiküler steatoz, lobüler inflamasyon, hepatosellüler balonlama ile sonuçlanan büyük lipid damlacıklarının artması da dahil olmak üzere şiddetli steatoz, ve yok edilmiş lobüler yapı yüksek yağlı diyet maruz farelerde bulunurken sadece bazı SPF farelerkaraciğerde hafif bir yağ birikimi gösterir.
Buna ek olarak, doğal öldürücü hücrelerin yüzdesi yüksek yağlı diyet maruz farelerin perigonadal yağ dokusunda daha yüksek, yüksek yağlı diyet SPF fareler dendritik hücrelerin daha yüksek yüzdeleri gösterdi ise. Bu yordamı denerken, aksi belirtilmedikçe hücreleri buz üzerinde ve karanlıkta tutmak önemlidir. Şimdi düzgün tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır ve nasıl akış sitometri deneyleriçin murine adipoz ve hepatik doku izole etmek.
