이 방법은 면역 대사 분야에서 면역 세포의 기여에 대 한 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다 비만 유도 염증에 대 한 지방 및 간 간염 조직에서 간염. 이러한 기술은 비특이적 병원체가 없는 설치류 하우징 하우징을 통해 달성된 무알코올 성 지방 간염의 식이 유발 모델에서 지방 및 간 면역 세포의 분리에 최적화되어 있다. 이 방법은 신진 대사 항상성의 유지에 관련 된 면역 메커니즘의 우리의 이해를 심화 하는 데 도움이 수 있습니다.
일반적으로, 이 기술에 새로운 개별은 기능적으로 실행 가능한 해리된 세포의 수율을 최대화하고 유동 세포 측정에 있는 적당한 게이팅을 설치하는 투쟁할 것입니다. 지방 조직 단일 세포 현탁액을 생성하려면 안락사 마우스의 가슴을 70 %에탄올로 분사하고 늑골 케이지의 전체 길이를 따라 정립 및 복벽을 통해 5 ~ 6 센티미터 의 중앙 절개를 조심스럽게 만들어 흉막과 심장을 노출시합니다. 26 게이지 바늘을 사용하여, 왼쪽 심실의 정점에 0.9 % 식염수 용액의 적어도 10 밀리리터를 주입하고 복막 구멍을 열기 위해 가위를 사용합니다.
그런 다음 epigonadal 지방 조직을 해부하고 무게를 측정합니다. 50 밀리리터 원피스 튜브로 조직 조각을 옮기기 전에 4도에서 페트리 접시에 지방 조직을 기계적으로 분리합니다. 페트리 접시에 0.5%의 소 세럼 알부민 또는 BSA를 PBS에 넣고, 지방 조직 1그램당 3밀리리터의 지방 조직 소화 용액을 튜브에 첨가합니다.
섭씨 37도, 분당 200회 회전에서 20분 후 PBS에 0.5%BSA의 5밀리리터를 추가하고 얼음 위에 지방 소화를 넣습니다. 10밀리리터 세로지컬 파이펫으로 솔루션을 여러 번 트리투레이하고 플런저를 사용하여 100마이크로미터 스트레이너를 통해 솔루션을 전달합니다. 조직 분획을 원심분리로 분리하고 파이펫을 사용하여 부동 지방 세포 분획을 버립니다.
기질 혈관 분수 세포 펠릿을 암모늄 염화 칼륨 또는 ACK, 리시스 버퍼의 1 밀리리터로 재중단하여 몇 초 후 PBS에서 2 %의 태아 종아리 혈청 또는 FCS의 10 밀리리터로 용해 반응을 중지합니다. 이어서, 원심분리에 의해 고립된 백혈구를 수집하고, 계산을 위해 PBS에서 2%FCS의 250 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 주사기 스탬프를 사용하여 페트리 접시에 조직을 기계적으로 해리하기 전에 얼음에 PBS의 원추형 튜브로 간을 수확 4섭씨.
해부된 간 조직 조각을 따뜻한 간 소화 용액 10밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 신선한 간 소화 용액 3밀리리터로 페트리 접시를 헹굽니다. 섭씨 37도에서 20분, 분당 200회 회전 후 HBSS 20밀리리터로 소화를 멈추고 10밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직 슬러리를 여러 번 세리세타트합니다. 플런저를 사용하여 100마이크로미터 스트레이너를 통과하고 원심분리로 간 세포를 수집합니다.
펠릿을 신선한 HBSS 20 밀리리터로 재중단하고 원심분리에 의해 간세포 매트릭스를 제거합니다. HBSS에서 33% 낮은 점도 밀도 그라데이션 배지 용액의 10 밀리리터에서 펠릿을 재중단하여 원심분리용 상체를 수집합니다. 간 면역 세포를 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 분리하고 ACK 용해 완충제의 1 밀리리터에서 백혈구 펠릿을 다시 중단합니다.
실온에서 4분 후, HBSS 10밀리리터로 용액을 멈추고 30마이크로미터 모공 스트레이너를 통해 세포를 원심분리를 위한 15밀리리터 튜브로 필터링합니다. 그런 다음, 계산을 위해 PBS에서 2%FCS의 250 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 고립 된 백혈구 집단의 유동 세포 측정 분석을 위해, 개별 폴리스티렌 형광 활성화 세포 선별, 또는 FACS, 튜브로 관심의 조직에서 PBS에서 2 %FCS의 100 마이크로 리터의 6 세포에 최대 3 배 10을 추가합니다.
각 튜브에 10개의 항 CD16/CD32 항체를 첨가하여 얼음에 10분 동안 비특이적 결합을 차단한 다음, 항체 혼합물의 적절한 부피와 시료당 생존성 염료 1편으로 염색하여 살아있는 세포 차별을 허용합니다. 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 20분 후, 시료를 2밀리리터 2밀리리터와 세척당 PBS, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 300배씩 세척합니다. 그런 다음, 신선한 PBS 플러스 FCS에서 펠릿을 다시 중단합니다.
유동 세포측정에 의해 세포를 분석하려면, 스테인드 네거티브 제어 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란을 설정하고, 유동 세포계의 전압을 조정하여 실행 가능한 백혈구 집단을 감지하고 이물질을 배제한다. 다음으로, 실험 샘플을 실행하기 전에 다색 보정을 위해 단일 스테인드 컨트롤 샘플을 실행하고 튜브 당 4개의 이벤트에 대해 최소 5회 10회 수집합니다. 그런 다음 분석을 위해 FCS 데이터 파일을 내보내고 CD45 양성 백혈구에 대한 게이팅 전략을 설정하여 후속 면역 세포 집단의 식별을 허용합니다.
여기서, 뮤린 페리고나달 지방에서 이중 차별 및 생존성 스테인링을 포함하는 T 세포 하위 집단을 위한 대표적인 게이팅 전략이 나타난다. CD45 양성 백혈구는 CD4 및 CD8에 대해 먼저 게이트되고 그 후 CD44 및 CD62 리간드에 대해 순진한, 중앙 메모리, 이펙터 메모리 및 이펙터 T 세포를 구별합니다. CD44 양성 세포는 CD127, 킬러 셀 렉틴 과 같은 수용체 G1 및 프로그램된 데스-1을 더 특징으로 합니다.
여기서, B 세포, 과립구, 자연 킬러 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 분석하기 위한 게이팅 전략이 도시된다. 이펙터 메모리 CD4 양성 및 CD8 양성 세포의 높은 비율은 비 SPF 조건에 수용 된 고지방 다이어트 마우스에서 검출 될 수 있지만, 반면 간 내 순진한 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포는 7 주에 SPF 고지방 다이어트 마우스에 비해 이러한 동물에서 상당히 낮은 것으로 나타났습니다. 중증 스테토시스는 대식체 스테토시스, lobular 염증, 간세포 풍선 및 파괴 된 lobular 구조의 증가를 포함하여 고지방 식단에서 발견되는 반면 일부 SPF 마우스만이 간에서 온화한 지방 축적을 나타낸다.
또한, 천연 킬러 세포의 비율은 고지방 식이 요법의 지방 조직에서 더 높으며, 고지방 식단 SPF 마우스는 수지상 세포의 높은 비율을 입증했다. 이 절차를 시도할 때, 그렇지 않으면 언급되지 않는 한 얼음과 어둠 속에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다. 이제 단일 세포 현탁액을 올바르게 준비하는 방법과 유동 세포 측정 실험을 위해 뮤린 지방과 간 조직을 격리하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
