Este método pode ajudar a responder perguntas no campo do imunometabolismo sobre a contribuição das células imunes para a inflamação induzida pela obesidade em adiposo e esteatohepatite no tecido hepático. Essas técnicas foram otimizadas para o isolamento de células imunes adiposas e hepáticas em um modelo induzido por dieta de esteatohepatite não alcoólica alcançada através de uma carcaça de roedores sem patógenos não específica. Esses métodos podem ajudar a aprofundar nossa compreensão dos mecanismos imunológicos envolvidos na manutenção da homeostase metabólica.
Geralmente, indivíduos novos nessa técnica lutarão para maximizar o rendimento de células dissociadas funcionalmente viáveis e configurar a gengura adequada na citometria de fluxo. Para gerar uma suspensão unicelular de tecido adiposo, pulverize o peito de um rato eutanizado com 70% de etanol, e faça cuidadosamente uma incisão central de cinco a seis centímetros através do integument e da parede abdominal ao longo de toda a extensão da caixa torácica para expor a cavidade pleural e o coração. Usando uma agulha de calibre 26, injete pelo menos 10 mililitros de solução salina de 0,9% no ápice do ventrículo esquerdo e use uma tesoura para abrir a cavidade peritoneal.
Em seguida, disseque o tecido adiposo epigonadal, e pese-o. Dissociar mecanicamente o tecido adiposo em pedaços finos em uma placa de Petri a quatro graus Celsius antes de transferir os fragmentos de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágüe a placa de Petri com um mililitro de 0,5% de albumina de soro bovino, ou BSA, na PBS, e adicione três mililitros de solução de digestão de tecido adiposo recém-preparada por grama de tecido adiposo ao tubo.
Após 20 minutos a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto, adicione cinco mililitros de 0,5% BSA na PBS e coloque o digestão adiposo no gelo. Triturar a solução várias vezes com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e usar um êmbolo para passar a solução através de um filtro de 100 micrômetros. Separe as frações teciduais por centrifugação e use uma pipeta para descartar a fração de adipócito flutuante.
Resuspend a pelota de célula de fração vascular estromal em um mililitro de amônio-cloreto-potássio, ou ACK, tampão de lise, interrompendo a reação de lise com 10 mililitros de soro de bezerro fetal de 2%, ou FCS, na PBS após alguns segundos. Em seguida, coletar os glóbulos brancos isolados por centrifugação, e resuspensar a pelota em 250 microliters de 2% FCS em PBS para contagem. Colher o fígado em um tubo cônico de PBS no gelo antes de usar selos de seringa para dissociar mecanicamente o tecido em uma placa de Petri a quatro graus Celsius.
Transfira os fragmentos de tecido hepático dissecado em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de solução de digestão hepática quente, e enxágue a placa de Petri com três mililitros de solução de digestão hepática fresca. Após 20 minutos a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto, pare a digestão com 20 mililitros de HBSS, e triturar o chorume tecidual várias vezes com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Use um êmbolo para passar a solução de tecido através de um coador de 100 micrômetros, e colete as células hepáticas por centrifugação.
Resuspend a pelota em 20 mililitros de HBSS fresco, e remova a matriz hepatocitte por centrifugação. Colete o supernatante para centrifugação, reutilizando a pelota em 10 mililitros de 33% de baixa solução de gradiente de densidade de viscosidade em HBSS. Separe as células imunes hepáticas por centrifugação gradiente de densidade, e resuspenque a pelota de leucócito em um mililitro de tampão de lise ACK.
Após quatro minutos em temperatura ambiente, pare a lise com 10 mililitros de HBSS e filtre as células através de um filtro de poros de 30 micrômetros em um tubo de 15 milímetros para centrifugação. Em seguida, resuspenja a pelota em 250 microliters de 2%FCS na PBS para contagem. Para análise citométrica de fluxo das populações isoladas de leucócitos, adicione três vezes 10 às seis células em 100 microliters de 2%FCS em PBS do tecido de interesse em triagem celular ativada por fluorescência individual de poliestireno, ou FACS, tubos.
Adicione 10 microliters de anticorpo anti-CD16/CD32 a cada tubo para bloquear qualquer ligação não específica por 10 minutos no gelo, seguida de coloração com o volume apropriado de mistura de anticorpos e um microliter de corante de viabilidade por amostra para permitir a discriminação celular viva e morta. Após 20 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz, lave as amostras duas vezes com dois mililitros de 2%FCS mais PBS por lavagem, e centrífuga a 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, resuspense a pelota em PBS fresco mais FCS.
Para analisar as células por citometria de fluxo, use uma amostra de controle negativo não manchada para definir a dispersão dianteira e lateral, e ajuste as tensões do citômetro de fluxo para detectar a população viável de leucócitos e excluir os detritos. Em seguida, execute amostras de controle colorido único para compensação multicolor antes de executar as amostras experimentais, coletando pelo menos cinco vezes 10 para os quatro eventos por tubo. Em seguida, exporte os arquivos de dados fcs para análise, e defina a estratégia de gating para leucócitos CD45 positivos para permitir a identificação das populações subsequentes de células imunes de interesse.
Aqui, uma estratégia representativa de gating para subpopulações de células T, incluindo discriminação dupla e coloração de viabilidade na gordura murina perigonadal é mostrada. Os leucócitos CD45 positivos são primeiro fechados para CD4 e CD8 e, posteriormente, para cd44 e CD62 ligand para discriminar entre células ingênuas, centrais, de efeitos e células T. As células CD44 positivas são então caracterizadas com CD127, receptor de lectina celular assassino G1, e morte programada-1.
Aqui, a estratégia de análise de células B, granulócitos, células assassinas naturais, macrófagos e células dendríticas é mostrada. Uma maior porcentagem de células T4-positivas e CD8 positivas de memória de efeitos e CD8 pode ser detectada em camundongos de dieta rica em gordura abrigadas em condições não-SPF, enquanto as células T inhênticas inhênticas e CD8-positivas são encontradas consideravelmente menores nesses animais em comparação com os camundongos dietéticos de alta gordura da SPF na semana sete. Esteatose grave, incluindo um aumento de grandes gotículas lipídicas resultando em esteatose macrovesicular, inflamação lobular, balonismo hepatocelular e estrutura lobular destruída é encontrada em camundongos expostos de dieta de alta gordura, enquanto apenas alguns camundongos SPF apresentam um leve acúmulo de gordura no fígado.
Além disso, a porcentagem de células assassinas naturais é maior no tecido adiposo perigoso de camundongos expostos à dieta rica em gordura, enquanto os camundongos de alta gordura demonstraram maiores percentuais de células dendríticas. Ao tentar este procedimento, é importante manter as células no gelo e no escuro, a menos que seja observado de outra forma. Agora você deve ter uma boa compreensão de como preparar adequadamente suspensões unicelulares e como isolar o adiposo murino e tecido hepático para experimentos de citometria de fluxo.
