Этот метод может помочь ответить на вопросы в области иммунометаболизма о вкладе иммунных клеток в ожирение индуцированного воспаления в жировой и стеатогепатит в печеночные ткани. Эти методы были оптимизированы для изоляции жировых и печеночные иммунные клетки в диете индуцированной модели безалкогольного стеатогепатита, достигнутые через неспецифические патогена свободной грызунов жилья. Эти методы могут помочь углубить наше понимание иммунологических механизмов, участвующих в поддержании метаболического гомеостаза.
Как правило, лица, новые для этой техники будет бороться с максимизацией урожайности функционально жизнеспособных диссоциированных клеток и создания надлежащего gating в потоке цитометрии. Для создания жировой ткани одноклеточной подвески, спрей груди усыпляемой мыши с 70% этанола, и тщательно сделать пять-шесть сантиметров центрального разреза через интеграмент и брюшной стенки по всей длине грудной клетки подвергать плевральной полости и сердца. Используя 26-калибровочной иглы, ввиснуть по крайней мере 10 миллилитров 0,9% солевого раствора в вершину левого желудочка, и использовать ножницы, чтобы открыть брюшной полости.
Затем, вскрыть эпигонадной жировой ткани, и взвесить его. Механически отмежевать жировую ткань на мелкие кусочки в чашке Петри при четырех градусах по Цельсию, прежде чем передать фрагменты ткани в 50-миллилитровую коническую трубку. Промыть чашку Петри с одним миллилитром 0,5%бычьего альбумин сыворотки, или BSA, в PBS, и добавить три миллилитров свежеприготовленной жировой ткани дайджест раствора на грамм жировой ткани в трубку.
Через 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту добавьте пять миллилитров 0,5%BSA в PBS и поместите жировой дайджест на лед. Тритурировать раствор несколько раз с помощью 10-миллилитрового серологического пипетки и использовать поршень, чтобы пройти раствор через 100-микрометровый ситечко. Разделите фракции тканей центрифугой и используйте пипетки, чтобы отбросить плавающую фракцию адипоцитов.
Resuspend стромальной сосудистой фракционной клеточной гранулы в один миллилитр аммония-хлорид-калия, или ACK, лиз буфера, останавливая реакцию лиза с 10 миллилитров 2%fetal теленка сыворотки, или FCS, в PBS через несколько секунд. Затем соберите изолированные белые кровяные тельца путем центрифугации, и повторно посовестить гранулы в 250 микролитров 2%FCS в PBS для подсчета. Урожай печени в конической трубки PBS на льду, прежде чем использовать шприц марки механически разъедать ткани в чашке Петри на четыре градуса по Цельсию.
Перенесите расчлененные фрагменты тканей печени в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров раствора теплого пищеварения печени, и промойте чашку Петри тремя миллилитров свежего раствора для переваривания печени. После 20 минут при 37 градусах Цельсия и 200 вращениях в минуту, остановить пищеварение с 20 миллилитров HBSS, и тритурировать навоз ткани несколько раз с 10-миллилитровой серологической пипетки. Используйте поршень, чтобы пройти раствор ткани через 100-микрометровый ситечко, и собирать клетки печени центрифугации.
Переусердствойте гранулы в 20 миллилитров свежего HBSS, и удалить матрицу гепатоцитов центрифугации. Соберите супернатант для центрифугации, повторно посовещение гранул в 10 миллилитров 33%низкой плотности вязкости среднего раствора в HBSS. Отделяйте иммунные клетки печени по плотности градиентной центрифугации и повторно помешайте гранулы лейкоцитов в один миллилитр буфера лиза ACK.
Через четыре минуты при комнатной температуре, остановитьлиз с 10 миллилитров HBSS, и фильтровать клетки через 30-микрометровый поры ситечко в 15-миллилитровую трубку для центрифугации. Затем, повторно гранулы в 250 микролитров 2%FCS в PBS для подсчета. Для цитометрического анализа потока изолированных популяций лейкоцитов, добавить до трех раз 10 до шести клеток в 100 микролитров 2%FCS в PBS из ткани, представляющие интерес в отдельных полистирола флуоресценции активированной сортировки клеток, или FACS, трубки.
Добавьте 10 микролитров антител anti-CD16/CD32 к каждой пробке для того чтобы заблокирует любое non-специфическое связывание на 10 минут на льду, после этого после этого запятнать с совествующим томом смеси антитела и одним микролитером красителя жизнеспособности в образец для того чтобы позволить различеству живых и мертвых клеток. Через 20 минут при четырех градусах Цельсия защищены от света, мыть образцы два раза с двумя миллилитров 2%FCS плюс PBS за стирку, и центрифуга в 300 раз g в течение пяти минут при четырех градусах цельсия. Затем, повторное производство гранул в свежем PBS плюс FCS.
Для анализа клеток по цитометрии потока используйте необлибряемый отрицательный контрольный образец для настройки рассеяния вперед и сбоку, а также для регулировки напряжения цитометра потока для обнаружения жизнеспособной популяции лейкоцитов и исключения мусора. Затем запустите одиночные окрашенные образцы управления для многоцветной компенсации перед запуском экспериментальных образцов, собирая по крайней мере пять раз 10 к четырем событиям на трубку. Затем экспорт файлы данных FCS для анализа, и установить стратегию gating для CD45-положительных лейкоцитов, чтобы позволить идентификацию последующих популяций иммунных клеток, представляющих интерес.
Здесь показана репрезентативная стратегия гатинга для субпопуляций Т-клеток, включая двойную дискриминацию и жизнеспособность окрашивания в мурин перигонадальный жир. CD45-положительные лейкоциты сначала закрыты для CD4 и CD8, а затем для CD44 и CD62 лиганда, чтобы различать наивную, центральную память, память эффектора и эффектор Т-клеток. CD44-положительные клетки затем дополнительно характеризуется CD127, убийца клеток лектин-как рецептор G1, и запрограммирован смерть-1.
Здесь показана стратегия анализа В-клеток, гранулоцитов, естественных клеток-убийц, макрофагов и дендритных клеток. Более высокий процент эффекторной памяти CD4-положительных и CD8-положительных клеток может быть обнаружен в высокожирных диетических мышей, размещенных в условиях, не в которых SPF, в то время как внутрицепочечные наивные CD4-положительные и CD8-положительные Т-клетки оказались значительно ниже у этих животных по сравнению с SPF с высоким содержанием жира диеты мышей на седьмой неделе. Тяжелый стеатоз, в том числе увеличение больших липидных капель в результате макровесикулярного стеатоза, лобкулярного воспаления, гепатоцеллюлярной воздухоплавания, и разрушенная лобкулярная структура находится в с высоким содержанием жира диеты подвергаются мышей в то время как только некоторые мышей SPF дисплей мягкого накопления жира в печени.
Кроме того, процент естественных клеток-убийц выше в перигонадальной жировой ткани с высоким содержанием жира диеты подвергаются мышей, в то время как с высоким содержанием жира диета SPF мышей продемонстрировали более высокий процент дендритических клеток. При попытке этой процедуры, важно держать клетки на льду и в темноте, если не указано иное. Теперь вы должны иметь хорошее понимание того, как правильно подготовить одноклеточные суспензии и как изолировать мурин жировой и печеночной ткани для цитометрии потока экспериментов.
