עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01HL089462 לSP.

1. הכנה ליפוזומים cationic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי בקבוק מסביב לתחתית נקי כדי לשמש להכנת lipososmes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - ממיסים 200 מ&quot;ג של אמוניום ברומיד dioctadecyl דימתיל (DOAB) בכלורופורם 10 מ&quot;ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - ממיסים 200 מ&quot;ג של כולסטרול בכלורופורם 10 מ&quot;ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - היכונו והחיטוי לעקר 5% גלוקוז ב100 מ&quot;ל של רנ&quot;א / מים מזוקקים חופשיים ה-DNA ASE. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבקבוק מסביב לתחתית עם כלורופורם. הוסף 5-10 מ&quot;ל לבקבוק, המערבולת, ולתת לו לשבת במשך כמה דקות. שמור את הבקבוק מכוסה ברדיד אלומיניום בכל העת. רוקן את כלורופורם מהבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ליפוזומים: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - הוספה 315 μl של פתרון מניות DOAB לבקבוק מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - הוספה 200 μl של פתרון מניות כולסטרול לבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - הוסף 9.5 מ&quot;ל של כלורופורם לבקבוקND לערבב על ידי מערבולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את rotavapor על 37 מעלות צלזיוס, 100 סיבובים לדקה (סל&quot;ד) או יותר (100-120 סל&quot;ד). Rotavapor צריך להיות מחובר לשליטת ואקום משאבת מים עם צינור יניקה המחוברת כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המכל גז הארגון וrotavapor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הבקבוק לrotavapor ולהתאים את ההגדרות האופטימליות לפני הורדתו באמבט המים. פתח את השסתום הראשון לארגון לחלוטין על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. תמיד לפתוח ולסגור את השסתום הזה ראשון. השסתום השני שולט בלחץ ניפוח בארגון לבקבוק. הלחץ צריך להיות עדין תמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את rotavapor באמבט המים, מספיק הבקבוק לגעת במים מבלי להיות שקוע לחלוטין ולהדליק את המהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שכל מתאדה כלורופורם, כ -10 דקות. ואז לעצור את המכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מהירות rotavapor ואת שסתומי טנקי הארגון. עכשיו יש להוציא את הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של 5% גלוקוז לבקבוק הדואר לפזר את השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את תחתית הבקבוק ביסודיות באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה לפזר את כל השומנים. לאחר הגירוד, להסיר כל שומנים שנותרו מקצה 1 מ&quot;ל לתוך הבקבוק, במידת צורך, עם קצה שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרון שהושג ב42 ° C אמבט מים תוך vortexing לאט (15 סל&quot;ד) הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מע&quot;מ sonicator עם מים קרים. Sonicate הפתרון לפחות 20-30 דקות עם הבקבוק והרים את התחתית רק בקושי נוגע במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הבקבוק באמבט המים של rotavapor במשך 20 דקות על 42 מעלות צלזיוס, במהירות אפס, עם התחתית העגולה שקועה במים, הפעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את יפוזומים דרך מיקרון 0.47 ולאחר מכן, 0.22 מסנני מזרק מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכבש קטן, לסנן את יפוזומים דרך קרום ננומטר 50 כדי לייצר אוכלוסייה הומוגנית של שלפוחית ​​liposome unilamellar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את יפוזומים לצינור Eppendorf ולמקם אותו על קרח. </li></ol><html> 2. הכינו את יפוזומים: siRNA-ITSN-1 תסביכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ITSN siRNA העכבר על היעד בחיץ siRNA המכיל 20 מ&quot;מ וHEPES נתרן כלורי 150mm, pH 7.4, לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. שמור את זה על קרח לפני הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את יפוזומים: מתחמי ITSN siRNA ביחס של 8 ליפוזומים nmol: 2 RNA מיקרוגרם (או 400 ליפוזומים nmol: ITSN siRNA מיקרוגרם 100). במחקר הנוכחי, שהוספנו 50 μl של ITSN siRNA מפתרון המניות (50 מיקרומטר) עד 100 μl של יפוזומים עתה הוכנו באמצעות צינור Eppendorf בחינם DNA-ASE RNA /. שימו לב שהריכוז של ITSN siRNA הוא מאוד חשוב, כי מקסימום של 150 μl של תערובת ניתן להזריק בילטרלי ורטרו מסלולית בעכבר בפעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התערובת על קרח בעת שהמתין כדי להזריק את העכברים. </li></ol> 3. הזרקה לוריד רטרו מסלולית עכבר (זווית פנימית של שקע העין) jove_content &quot;&gt; כל ניסויי העכבר אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הטיפול של אוניברסיטת Rush בבעלי חיים המוסדיים ועדת שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף ומשקל גוף 5 xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג (תערובת זמינה מסחרי). בהתאם למשקל וגיל בעלי החיים, להתאים את עוצמת קול וריכוז ההרדמה. העכברים ששמשו במחקר העכברים הם CD1 עכברי זכרים, 6-8 שבועות ושוקלים סביב 25 גרם. את המזרקים הם סוג טוברקולין 1 מ&quot;ל עם המחט מחוברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את אוזני עכבר ביד אחת ולהפוך את העכבר למטה בצד לחשוף את הזווית הפנימית של העין. המטרה המדיאלי לsemilunaris plica; להימנע מלגעת בגלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב לcaruncle הדמע של העין מחזיקה את המזרק המכיל את התערובת בזווית של 45 מעלות בכל שלושת הצירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את התערובת ולתת לעכבר כדי להתאושש עם הצד המוזרק למעלה. אם נוזל גדולצורות רביב במקום החדרת המחט, לחזור בו מחט, שאיבה בחזרה הטיפה לתוך המזרק ונסו שוב. זריקות חוזרות ונשנות נעשות על ידי מיטב לסירוגין את העיניים, כדי לאפשר התאוששות מושלמת. אם אינך בטוח, ניתן לבדוק בטכניקה זו על ידי הזרקת צבע כחול (50 μl, סגול גביש 0.5% במתנול) וחושף את ריאות העכבר כדי לבחון את כלי הדם הכחולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכברים במחקר זה הוזרקו כל יום 3 rd במשך 3 שבועות ללא הרוגים או תופעות לוואי. </li></ol> 4. זלוף עכבר ריאות ואוסף רקמות ללימודים ביוכימיה <ol start="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת peristaltic לרוץ ב1.5 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההגדרה: מכונת הנשמה, שולחן ניתוחים, מכשירים, צמר גפן סטרילי, Q-טיפים, מחרוזות, כוסות, מים מזוקקים, מלח מאוזן של האנק, נותב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי זריקת intraperitoneal של תערובת ההרדמה (קטמין 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף ומשקל הגוף xylazine 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברמת הצוואר, להסיר את בלוטות הרוק ולחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם laparotomy, בלו הסרעפת, ופעל עם פתיחת בית החזה, חושף את הריאות ואת הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התימוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ האור לדיוק טוב יותר, לצנתר את העורק הריאתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הנשמה וצנרר העכבר באמצעות tracheostoma. הגדר את מכונת ההנשמה לשיעור של 150 מקרי שבץ / דקה ונפח פעימה של 150 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפורקן, לפתוח את הפרוזדור השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse כלי דם הריאה העכבר ללא דם במשך 5 דקות, תוך שימוש בפתרון של האנק המשאבה וperistaltic חימם על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse נותב (8 ננומטר זהב אלבומין 16) לתוספת 10 דקות באותו קצב הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נותב מאוגד על ידי זלוף ריאות דקות 5 עם פתרונו של האנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל עם קיבוע באתרו של הריאות על ידי 10 זלוף דקות של 4% (wt / כרך) פורמלדהיד, 2.5% glutaraldehyde, ו -1% חומצה טאני ב0.1 צינורותחיץ, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הריאות, להסיר את הרקמה המוגזמת, לחתוך קוביות קטנות (3/3 מ&quot;מ), ומניח אותם לבקבוקון נצנץ כותרת המכיל 2 מ&quot;ל של תערובת מקבע. </li></ol> העכברים יפוגו בהרדמה מלאה במהלך ההליך. 5. עיבוד רקמת ריאה עכבר לEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות מניות: 1% Palade 4 oso, אצטט הוורונל, וחיץ קלנברגר. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1% חיץ Palade-oso 4 מכיל: 1 מיליליטר מניית אצטט הוורונל, 1.25 מ&quot;ל 4% 4 oso, 1 מ&quot;ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, ומים מזוקקים עד 5 מ&quot;ל של נפח סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - פתרון מניות הוורונל אצטט מתקבל על ידי המסת 1.15 andydrous גרם נתרן אצטט ו2.94 g barbital ב100 מ&quot;ל של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון-קלנברגר מכיל 2 מ&quot;ל של מניית הוורונל אצטט, 2.8 מ&quot;ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, 0.05 אצטט uranyl גרם, ו5.1 מ&quot;לשל מים מזוקקים, pH = 6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את גושי הריאה ב0.1 מ &#39;נתרן cacodylate חיץ, pH = 7.4, 3 פעמים לזמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הדגימות ב4% (wt / כרך) פורמלדהיד, glutaraldehyde 2.5% בחיץ צינורות 0.1, pH 7.2, עבור שעה 1, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן עם Palade-אוסמיום 1% עבור שעה 1 במכסת המנוע, על קרח, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעם אחת עם חיץ קלנברגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בקלנברגר חיץ במשך שעה 2 ללילה, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעם אחת ב 50% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש עם סדרה מדורגת של אתנול, 5 דקות / כל אחד: 70%, 95%, ולאחר מכן 2 x 15 דקות 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ל -100% פרופילן אוקסיד, 2 x 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פרופילן אוקסיד ולהוסיף תערובת של 50% פרופילן אוקסיד ו -50% EPON 812, דגירה הלילה, מסתובב על גלגל, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את התערובת ולהוסיף 812 EPON הטרי, לפחות עבור שעות 4-5 על ההגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתבניות הוכפלו מחודדות, מלאותחצי דרך עם 100% טריים EPON 812, להוסיף דגימות נבחרות ולמקם אותם לקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התבניות לסט החממה ב 60 ° C ולתת להם לרפא במשך 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר polymerized, לשלוח את אבני להיות רזה (60-70 ננומטר עבה) מחולק. </li></ol>

<ol>
	<li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells.">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium.">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).</li><li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs:+recent+progress.">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li><li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposome/DNA+complexes:+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes.">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li><li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin:+more+than+charge+alone.">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li><li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells.">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li><li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בהתבסס על מחקרים קודמים שפורסמו על ידי אחרים ו9 1, 18 שפתחנו מתודולוגיה זו לטווח ארוך להפיל של ITSN-1S in vivo על ידי עירוי לוריד חזר (בכל שעה 72, במשך 24 ימים רצופים) של siRNA הספציפי / מתחמי liposome. גישה ניסויית זה היא יעילה, בטוח לשימוש ושוב ושוב וניתן להרחיב אותו בקלות כדי...

siRNA בלתי מזוינת לא יכול לחדור את קרום התא, שטעון שלילי, וזה בקלות מושפל על ידי אנזימים בדם, רקמות ותאים. אפילו עם לאחרונה שינויים מבניים לשיפור יציבות, הצטברות siRNA באתר היעד לאחר מתן היא נמוכה ביותר ודורשת רכב תאי יעיל 5. ליפוזומים קטיוני התפתחו כנשאים חומצות גרעין בטוחים עם הפוטנציאל להעברת חלקים גדולים של ה-DNA / RNA לתאים על ידי encapsulating והגנה על חומצות גרעין משפלה האנזימטית 6. כמו כן, ליפוזומים קטיוני אינטראקציה באופן ספונטני עם DNA / RNA, ובכך לקדם העברת גנים לתאים 2. לאחרונה יפוזומים יושמו כדי לספק חיסונים ותרופות מולקולריים נמוכה במשקל 7. משלוח liposomal של microRNA-7-להביע פלסמיד מתגבר על גורם הקולטן טירוזין קינאז מעכב גדילה באפידרמיס-התנגדות בתאי סרטן ריאות 8. כאשר מיקודהאנדותל של כלי דם, האספקה ​​תוך ורידי הוא חיוני משום המתחמים צפויים לחצות את מחסום האנדותל וextravasate לinterstitium 9. על ידי השוואה לאיברים אחרים, ECS מmicrovasculature של הריאה יש הספיגה הגדולה ביותר בשקיקה ולהפנים יפוזום קטיוני ומתחמי DNA / RNA, ואחריו את בלוטות הלימפה והטלאים של Peyer 9. משלוח תוך ורידי במודלים של מכרסמים של siRNA באמצעות זריקות וריד רטרו מסלולית או זנב הוכח בלתי מזיק גם בריכוזים גבוהים, כגון 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג 10. בספרות שפורסמה בהרכב ליפוזומים קטיוני שונה, המבוסס על ניסוח שומנים והיחס שלהם equimolar 11, 12. יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באמצעות ליפוזומים קטיוני למסירת גן in vivo, בין אם מיקוד down-regulation/over-expression של החלבונים, משלוח של חיסונים או טיפולים אנטי סרטניים 13-15. חשוב לזכורהוא שהיעילות של אינטראקציה קרום DNA / RNA-הסלולר מוסדרת על ידי צורת צימוד בין מתחמים שנוצרו ושומנים בממברנה. הדבר מצביע על כך חייטות הרכב שומנים לפרופילי הממברנה התאיים הממוקדים עשויה להיות מועילה ותוצאה בשיעור גבוה של transfection בסוג תא מסוים 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

מחקרים קודמים הראו כי מציאה של ITSN-1S (KD ITSN), חלבון endocytic המעורב בויסות חדירות כלי דם וריאות תאי האנדותל (ECS) הישרדות, מוות של תאי אפופטוטיים מושרה, מכשול עיקרי בפיתוח מערכת תרבית תאים עם ITSN-1S ממושך עיכוב 1. באמצעות ליפוזומים קטיוני כנשאים, בחן את ההשתקה של גן ITSN-1S בעכבר ריאות על ידי ממשל מערכתי של siRNA גן מיקוד ITSN-1 (ITSN siRNA). ליפוזומים קטיוני מציעים מספר יתרונות למסירת siRNA: בטוח במינון חוזר ונשנה, nonimmunogenic, רעילים, וקלים לייצור 2. ביצועים ליפוזומים ופעילות ביולוגית שלהם תלויות בגודל, תשלום, שומנים הרכב, יציבות, מינון ודרך מתן 3 הנה, יעיל והספציפי בITSN KD ריאות עכבר הושג באמצעות שילוב רומיד אמוניום dioctadecyl כולסטרול ודימתיל. משלוח תוך ורידישל ITSN siRNA / מתחמי liposome קטיוני דפקו transiently למטה חלבון ITSN-1S וmRNA בעכבר ריאות ביום 3, שהתאושש לאחר 3 ימים נוספים. מנצלים את יפוזומים קטיוני כמוביל בטוח הדיר, המחקר הוארך למשך 24 ימים. לפיכך, טיפול רטרו מסלולית עם מתחמים טריים שנוצרו היה מנוהל בכל יום 3, גרימת ITSN KD המתמשך לאורך כל תקופת המחקר 4. רקמות עכבר שנאספו במספר הנקודות ITSN לאחר זמן siRNA היו נתונים למיקרוסקופים אלקטרונים (EM) ניתוחים כדי להעריך את ההשפעות של KD ITSN הכרוני, בהאנדותל ריאות. רזולוציה גבוהה EM הדמיה אפשרה לנו להעריך את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי KDITSN במיטת כלי דם הריאה (כלומר שיבוש של מכשול אנדותל, מספר caveolae וupregulation של מסלולי תחבורה חלופיים ירד), מאפיינים שאינם לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור. בסך הכל ממצאים אלו הוקמו imporהתפקיד של TANT ITSN-1S בתפקוד ECs והומאוסטזיס ריאות, ואילו הממחיש את היעילות של ליפוזומים משלוח siRNA בin vivo.

רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1s היו במעקב במספר נקודות זמן לאחר לידת ITSN siRNA ידי כתם המערבי וPCR הקונבנציונלי וכמותית בכ4. רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1S בעכבר ריאות שטופלו ITSN siRNA היו כ -75% נמוכים יותר על ידי התייחסות לבקרות במהלך מתמדת של מציאה ITSN-1S במשך 21 ימים. ללא ITSN-1S, dynamin-2...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Elect

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

long-term-silencing-intersectin-1s-mouse-lungs-repeated-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  Rush University. זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

Video: Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...