הבנת הבסיס הפיזי של הרכבה עצמית של חלבון בתאים מוגבלת על ידי היעדר כלים מתאימים. השיטות הנוכחיות סובלות מרגישות נמוכה, הקריאות עקיפות, תפוקה מוגבלת ו/או רזולוציית רמת אוכלוסייה. לעומת זאת, ההערכה שלנו מזהה ומכומתת את הנטייה של חלבון להרכבה עצמית ב-vivo עם תא אחד רגיש, תפוקה גבוהה ללא קשר לוקליזציה של חלבון או מיסות.
כאשר הראשון מנסה את הבדיקה, מקבל את ההמרה תמונה נכון עשוי לדרוש כמה בדיקות אמפיריות כדי להשיג תנאים אופטימליים להשגת קריאה טובה על פני הצלחת כולה. הרגישות של ההתדגם עלולה להיפגע גם אם לציטומטר אין מסנני זיהוי נפרדים עבור אותות FRET ומקבל. מדגים את ההליך איתי יהיה אנדרו בוקס, מנהל המעבדה של ליבת הציטומטריה.
כדי להכין תרבות שמרים עבור DAmFRET, עבור כל חלבון שאילתה, לחסן את מושבות שמרים טרנספורמציה ב 200 microliters של מדיום צמיחה מתאים שאינו מעורר בארות בודדות של צלחת תרבות תחתונה 96 עגול היטב. הדגירה את תאי השמרים עם רועד עם מסלול 1.5 מילימטר ב 1, 200 סיבובים לדקה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. בסוף הדגירה, מסיסים את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה ומסירים את העל-טבעיים על ידי היפוך כוחני.
מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום אינדוקציה מתאים ומחזירים את התאים לאנקובטור הרועד למשך 12 שעות נוספות. בסוף הדגירה, מסיסים את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה והיפוך כוחני, ואז מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום אינדוקציה טרי. לאחר מכן הדגירה את התאים עם רועד במשך ארבע שעות נוספות כדי להפחית את הפלואורסצנטיות האוטומטית.
כדי לצלם את הדגימות, הנח את הצלחת ללא המכסה מתחת למנורה אולטרה סגולה המצויד במסנן 320 עד 500 ננומטר ומ collimator קרן ממוקם 45 ס"מ מעל הצלחת. הפעל את המנורה לתמונה להמיר את התאים במשך 25 דקות עם רעידות. עבור איסוף נתונים DAmFRET, לטעון את התאים המומרים תמונה על ציטומטר זרימת הדמיה עם לייזרים שאינם קוליניר 488 ו 561 ננומטר ושער ארבעה תאים בודדים unbudded על ידי מעגליות גבוהה ושער תא קטן.
ואז לאסוף נתונים עבור פעמיים עד חמש פעמים 10 לארבעת התאים הבודדים לכל מדגם בתוך שער חיובי פלואורסצנטי. בסוף הניתוח, השתמש מדגם mEos3.1 שאינו מומר תמונה עבור אות התורם הטהור DsRed מונומרית שתיים עבור אות מקבל טהור כדי להגדיר את הפיצוי. לקבלת רגישות רבה יותר, ודא כי ערוץ גלאי FRET נחשב גם כיעד זליגה בתוכנית הניתוח.
חשב את הפרמטר AmFRET כיחס של אות FRET הכולל חלקי אות מקבל FRET הכולל. פרופילי AmFRET של תאי שמרים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בלבד מפגינים AmFRET זניח בעוד שתאי שמרים המבטאים הומו-אוליגומר יציב מותך לחלבון הפלואורסצנטי מדגימים ערכי AmFRET חיוביים אחידים. תמונות של התאים שנרכשו על ידי ציטומטריית זרימת הדמיה חושפות פלואורסצנטיות מפוזרת בכל הערוצים.
מיקרוסקופ קונפוקל של ערימות Z עבור שדות מרובים של תאים מראה התפלגות אחידה של הפלואורסצנטיות לאורך הציטוסול של כל תא ללא פנצ'טה הניתנת לגילוי. תאי שמרים המבטאים את הפלואורופור לבדו או את הפלואורופור בתוספת הצורה המוטנטית של תערוכת חלבון מודלקת אנושית AmFRET זניחה לאורך כל טווח הריכוז המצביעה על חוסר יכולת לקיים אינטראקציה עצמית. לעומת זאת, חלבון מודלק מסוג פראי מדגים פרופיל DAmFRET עם אוכלוסיית AmFRET זניחה אחת ואוכלוסיית AmFRET גבוהה אחת.
שים לב כי חלבון מודלק מסוג הבר מתנגד להרכבה עצמית גם בריכוזים גבוהים כאשר החלבון עובר לצורת ההרכבה העצמית רק בחלק קטן מהתאים. זוהי אינדיקציה ברורה לקיומו של מחסום גרעין להרכבה עצמית. כפי שאושר על ידי הדמיה פלואורסצנטית, אוכלוסיות אלה מייצגות תאים המכילים חלבון מסיס בלבד או בעיקר חלבון בהרכבה עצמית בהתאמה.
ואכן, DAmFRET מאמת נתונים מבניים קודמים כי מוטנט הנקודה ב להצית משבש את הגרעין על פני הריכוזים בר השגה על ידי מערכת ביטוי זו. שים לב כי פרופילי ביטוי חלבון בתאי יונקים חסרי ביטוי Caspase-1 דומים לאלה שנצפו בתאי שמרים. הצעד החשוב ביותר שיש לזכור הוא המרת התמונות.
צעדים קריטיים אחרים כוללים איסוף מספר מספיק של אירועים אינם רוויים לאות פלואורסצנטיות והתקנת הפיצוי. מעקב אחר ההתמדה עם ביוכימיה מתאימה, מוטגנזיס רציונלי וגישות ביולוגיה מבנית יכול לעזור להבהר באופן מלא את מנגנון ההרכבה העצמית.
