Comprendere le basi fisiche dell'auto-assemblaggio proteico nelle cellule è limitato dalla mancanza di strumenti appropriati. I metodi attuali soffrono di bassa sensibilità, letture indirette, velocità effettiva limitata e/o risoluzione a livello di popolazione. Al contrario, il nostro saggio rileva e quantifica la propensione di una proteina per l'auto-assemblaggio in vivo con una lettura sensibile, a singola cellula, ad alta produttività indipendentemente dalla localizzazione o solubilità delle proteine.
Quando si prova il test per la prima volta, ottenere il diritto di conversione delle foto potrebbe richiedere alcuni test empirici per ottenere condizioni ottimali per ottenere una buona lettura su tutta la piastra. La sensibilità del saggio potrebbe anche essere compromessa se il citometro non dispone di filtri di rilevamento separati per i segnali FRET e accettore. A dimostrare la procedura con me sarà Andrew Box, il direttore di laboratorio del nucleo di citometria.
Per preparare una coltura di lievito per DAmFRET, per ogni proteina di query, inoculare le colonie di lievito trasformato in triplice copia in 200 microlitri di un mezzo di crescita non induttore appropriato in singoli pozzi di una piastra di coltura inferiore ben rotonda 96. Incubare le cellule di lievito con tremare con un'orbita di 1,5 millimetri a 1.200 rotazioni al minuto a 30 gradi Celsius per 16 ore. Alla fine dell'incubazione, sedimentare le cellule di lievito mediante centrifugazione e rimuovere i soprintaenti per inversione forzata.
Aggiungere 200 microlitri di un mezzo di induzione appropriato e riportare le cellule nell'incubatrice di scuotimento per altre 12 ore. Al termine dell'incubazione, sedimentare le cellule di lievito per centrifugazione e inversione forzata, quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di induzione fresco. Quindi incubare le cellule con scuotimento per altre quattro ore per ridurre l'autofluorescenza.
Per convertire foto i campioni, posizionare la piastra senza la copertura sotto una lampada ultravioletta dotata di un filtro da 320 a 500 nanometri e un collimatore a fascio posizionato 45 centimetri sopra la piastra. Accendere la lampada in foto convertire le cellule per 25 minuti con scuotimento. Per la raccolta dei dati DAmFRET, caricare le celle convertite foto su un citometro a flusso di imaging con laser non colineari da 488 e 561 nanometri e gate quattro singole celle nonbudded per alta circolarità e una piccola area cellulare.
Quindi raccogliere dati da due a cinque volte 10 alle quattro singole cellule per campione all'interno di un gate positivo alla fluorescenza. Al termine dell'analisi, utilizzare un campione mEos3.1 non convertito per il segnale donatore puro e dsred monomerico due per il segnale di accettore puro per impostare la compensazione. Per una maggiore sensibilità, assicurarsi che anche il canale del rivelatore FRET sia considerato come il bersaglio di spillover nel programma di analisi.
Calcolare il parametro AmFRET come rapporto del segnale FRET totale diviso per il segnale accettore FRET totale. I profili AmFRET delle cellule di lievito che esprimono solo proteine fluorescenti mostrano AmFRET trascurabile mentre le cellule di lievito che si esprimono come omooligomero stabile fuso alla proteina fluorescente dimostrano valori AmFRET positivi uniformi. Le immagini delle cellule acquisite dalla citometria del flusso di imaging rivelano una fluorescenza diffusa in tutti i canali.
La microscopia confocale delle pile Z per più campi di cellule mostra una distribuzione uniforme della fluorescenza in tutto il citosolo di ogni cellula senza puncta rilevabile. Le cellule di lievito che esprimono il fluoroforo da sole o il fluorofore più la forma mutante di una proteina infiammammasa umana mostrano amfret trascurabile su tutto l'intervallo di concentrazione che indica un'incapacità di interagire autonomamente. Al contrario, la proteina infiammammasa di tipo selvatico dimostra un profilo DAmFRET con una popolazione AmFRET trascurabile e un'alta popolazione AmFRET.
Si noti che la proteina infiammammasoma di tipo selvatico resiste all'auto-assemblaggio anche ad alte concentrazioni con la proteina che passa alla forma auto-assemblata solo in una frazione delle cellule. Questa è una chiara indicazione dell'esistenza di una barriera di nucleazione all'auto-assemblaggio. Come confermato dall'imaging a fluorescenza, queste popolazioni rappresentano cellule che contengono rispettivamente solo proteine solubili o proteine per lo più auto-assemblate.
Infatti, DAmFRET conferma i dati strutturali precedenti che il mutante punto nell'infiammammano interrompe la nucleazione attraverso le concentrazioni ottenibili da questo sistema di espressione. Si noti che i profili di espressione proteica nelle cellule di mammifero prive di espressione di Caspasi-1 assomigliano a quelli osservati nelle cellule di lievito. Il passo più importante da ricordare è la conversione di foto.
Altri passaggi cruciali includono la raccolta di un numero sufficiente di eventi che non sono saturi per il segnale di fluorescenza e ottenere la compensazione corretta. Seguire il saggio con adeguati approcci biochimici, mutagenesi razionale e biologia strutturale può aiutare a chiarire completamente il meccanismo dell'auto-assemblaggio.
