Comprender la base física del autoensamble de proteínas en las células está limitado por la falta de herramientas adecuadas. Los métodos actuales sufren de baja sensibilidad, lecturas indirectas, rendimiento limitado y/o resolución a nivel de población. Por el contrario, nuestro ensayo detecta y cuantifica la propensión de una proteína para el autoensamble in vivo con una lectura sensible, de una sola célula y de alto rendimiento, independientemente de la localización o solubilidad de proteínas.
Al probar por primera vez el ensayo, obtener la conversión de la foto correcta puede requerir algunas pruebas empíricas para obtener condiciones óptimas para lograr una buena lectura en toda la placa. La sensibilidad del ensayo también podría verse comprometida si el citómetro no tiene filtros de detección separados para las señales FRET y acceptor. Demostrando el procedimiento conmigo estará Andrew Box, el gerente de laboratorio del núcleo de citometría.
Para preparar un cultivo de levadura para DAmFRET, para cada proteína de consulta, inocular las colonias de levadura transformadas en triplicado en 200 microlitros de un medio de crecimiento no inductivo apropiado en pozos individuales de una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pozos. Incubar las células de levadura con temblores con una órbita de 1,5 milímetros a 1.200 rotaciones por minuto a 30 grados centígrados durante 16 horas. Al final de la incubación, sedimentar las células de levadura por centrifugación y eliminar los sobrenadantes por inversión contundente.
Añadir 200 microlitros de un medio de inducción adecuado y devolver las células a la incubadora de agitación durante otras 12 horas. Al final de la incubación, sedimentar las células de levadura por centrifugación e inversión contundente, luego añadir 200 microlitros de medio de inducción fresco. Luego incubar las células con agitación durante cuatro horas adicionales para reducir la autofluorescencia.
Para convertir fotos las muestras, coloque la placa sin la cubierta debajo de una lámpara ultravioleta equipada con un filtro de 320 a 500 nanómetros y un colimador de haz situado 45 centímetros por encima de la placa. Encienda la lámpara para convertir fotos las celdas durante 25 minutos con agitación. Para la recopilación de datos DAmFRET, cargue las células convertidas con foto en un citómetro de flujo de imágenes con láseres de nanómetros 488 y 561 no colineales y puerta cuatro células sin presupuestar individuales por alta circularidad y un área de células pequeñas.
Luego recopile datos de dos a cinco veces 10 a las cuatro celdas individuales por muestra dentro de una puerta positiva de fluorescencia. Al final del análisis, utilice una muestra mEos3.1 no convertida en foto para la señal de donante puro y DsRed monomérico dos para la señal de aceptador puro para establecer la compensación. Para una mayor sensibilidad, asegúrese de que el canal del detector FRET también se considera como el objetivo de contagio en el programa de análisis.
Calcule el parámetro AmFRET como la relación de la señal FRET total dividida por la señal total del aceptador FRET. Los perfiles AmFRET de células de levadura que expresan proteína fluorescente por sí solos exhiben AmFRET insignificante, mientras que las células de levadura que expresan como homooligomero estable fusionados a la proteína fluorescente demuestran valores positivos uniformes de AmFRET. Las imágenes de las células adquiridas por la citometría de flujo de imágenes revelan una fluorescencia difusa en todos los canales.
La microscopía confocal de pilas Z para múltiples campos de células muestra una distribución uniforme de la fluorescencia a través del citosol de cada célula sin puncta detectable. Las células de levadura que expresan el fluoróforo solo o el fluoróforo más la forma mutante de una proteína inflammasoma humana exhiben AmFRET insignificante en todo el rango de concentración que indica una incapacidad para autointertravirse. Por el contrario, la proteína inflammasoma de tipo salvaje demuestra un perfil DAmFRET con una población AmFRET insignificante y una alta población de AmFRET.
Tenga en cuenta que la proteína inflammasoma de tipo salvaje resiste el autoensamblaje incluso a altas concentraciones con el cambio de proteína a la forma autoensamblada en sólo una fracción de las células. Esto es una clara indicación de la existencia de una barrera de nucleación para el autoensamble. Como confirman las imágenes por fluorescencia, estas poblaciones representan células que contienen proteínas solubles solamente o en su mayoría proteínas autoensambladas respectivamente.
De hecho, DAmFRET corrobora los datos estructurales previos que el mutante de punto en el inflammasome interrumpe la nucleación a través de las concentraciones alcanzables por este sistema de expresión. Tenga en cuenta que los perfiles de expresión de proteínas en células de mamíferos que carecen de expresión de Caspase-1 se asemejan a los observados en las células de levadura. El paso más importante a recordar es la conversión de fotos.
Otros pasos cruciales incluyen la recopilación de un número suficiente de eventos que no están saturados para la señal de fluorescencia y obtener la compensación correcta. El seguimiento del ensayo con la bioquímica adecuada, la mutagénesis racional y los enfoques de biología estructural pueden ayudar a dilucidar completamente el mecanismo del autoensamble.
