Hücrelerde protein kendini birleştirme fiziksel temelini anlamak uygun araçların eksikliği ile sınırlıdır. Mevcut yöntemler düşük duyarlılık, dolaylı okumalar, sınırlı iş kaynağı ve/veya popülasyon düzeyi çözümlemesi ile muzdarip. Buna karşılık, bizim testi algılar ve protein lokalizasyonu veya çözünürlüğü ne olursa olsun hassas, tek hücreli, yüksek iş çıkış okuma ile kendi kendine montaj in vivo için bir protein eğilimini ölçer.
Ttük ilk çalışırken, fotoğraf dönüştürme hakkını almak, tüm plaka boyunca iyi bir okuma elde etmek için en uygun koşulları elde etmek için bazı ampirik testler gerektirebilir. Sitometrede FRET ve acceptor sinyalleri için ayrı algılama filtreleri yoksa, tözlerin hassasiyeti de tehlikeye atılabilir. Prosedürü benimle birlikte göstermek Andrew Box olacak, sitometri çekirdeğinin laboratuvar müdürü.
DAmFRET için bir maya kültürü hazırlamak için, her sorgu proteini için, 96 iyi yuvarlak alt kültür plakasının tek tek kuyularında uygun olmayan bir büyüme ortamının 200 mikrolitresinde dönüştürülmüş maya kolonilerini triplicate olarak aşılama. 1,5 milimetrelik bir yörünge ile sallayarak maya hücreleri kuluçka 16 saat boyunca 30 derece santigrat dakikada 200 dönüşler. Kuluçka sonunda, santrifüj ile maya hücreleri tortu ve güçlü inversiyon tarafından supernatants kaldırın.
Uygun bir indüksiyon ortamı200 mikrolitre ekleyin ve başka bir 12 saat için sallayarak kuvöz hücreleri iade. Kuluçka sonunda, santrifüj ve güçlü inversiyon ile maya hücreleri tortu, sonra taze indüksiyon orta 200 mikrolitre ekleyin. Sonra otomatik floresan azaltmak için ek bir dört saat boyunca sallayarak hücreleri kuluçka.
Örnekleri fotoğrafa dönüştürmek için, kapağı olmayan plakayı 320 ila 500 nanometre filtre ve plakanın 45 santimetre yukarısında konumlandırılmış bir ışın kolimatörle donatılmış ultraviyole lambanın altına yerleştirin. Fotoğraf sallamak ile 25 dakika boyunca hücreleri dönüştürmek için lambayı açın. DAmFRET veri toplama için, fotoğraf dönüştürülmüş hücreleri kolineer olmayan 488 ve 561 nanometre lazerlerle bir görüntüleme akış sitometresine yükleyin ve yüksek dairesellik ve küçük bir hücre alanı ile dört tek bir unbudded hücreleri kapısı.
Daha sonra floresan pozitif bir kapı içinde örnek başına dört tek hücre için 2 ila 5 kez 10 veri toplamak. Analizin sonunda, saf donör sinyali için fotoğrafdışı dönüştürülmüş mEos3.1 numunesi ve telafiyi ayarlamak için saf kabul sinyali için monomerik DsRed iki örnek kullanın. Daha fazla hassasiyet için FRET dedektör kanalının analiz programında yayılma hedefi olarak da değerlendirilmesini sağlayın.
AmFRET parametresini toplam FRET kabul sinyaline bölünen toplam FRET sinyalinin oranı olarak hesaplayın. Floresan proteini tek başına ifade eden maya hücrelerinin AmFRET profilleri ihmal edilebilir AmFRET gösterirken, floresan proteine bağlanan kararlı homooligomer olarak ifade edilen maya hücreleri tek tip pozitif AmFRET değerlerini gösterir. Görüntüleme akışı sitometrisi ile elde edilen hücrelerin görüntüleri tüm kanallarda dağınık bir floresan ortaya koymaktadır.
Hücre birden fazla alan için Z yığınlarının konfokal mikroskopisi, floresan'ın her hücrenin sitosolboyunca tek tip bir dağılımını ve saptanabilir puncta'yı göstermez. Tek başına florofor veya florofor artı bir insan inflamatuar protein mutant formu ifade maya hücreleri kendini etkileşim için bir yetersizlik gösteren tüm konsantrasyon aralığı üzerinde ihmal edilebilir AmFRET sergiler. Buna karşılık, yabani tip inflammasome protein bir ihmal edilebilir AmFRET popülasyonu ve bir yüksek AmFRET popülasyonu ile DAmFRET profili gösterir.
Yabani tip inflammasome protein hücrelerin sadece bir kısmını kendi kendine monte formuna protein geçiş ile yüksek konsantrasyonlarda bile kendi kendine montaj karşı olduğunu unutmayın. Bu, kendi kendini birleştirme için bir çekirdeklenme bariyerinin varlığının açık bir göstergesidir. Floresan görüntüleme ile doğrulanan gibi, bu popülasyonlar sırasıyla sadece çözünür protein veya çoğunlukla kendi kendine birleştirilmiş protein içeren hücreleri temsil eder.
Gerçekten de, DAmFRET, iltihaplanmadaki nokta mutantın bu ifade sistemi tarafından ulaşılabilen konsantrasyonlar arasında çekirdekleşmeyi bozduğuna dair önceki yapısal verileri doğrular. Caspase-1 ekspresyonu olmayan memeli hücrelerindeki protein ekspresyonu profillerinin maya hücrelerinde gözlenenlere benzediğini unutmayın. Hatırlanması gereken en önemli adım fotoğraf dönüşümüdür.
Diğer önemli adımlar arasında floresan sinyali için doygun olmayan yeterli sayıda olayın toplanması ve tazminatın doğru şekilde ödenmesi yer almaktadır. Uygun biyokimya ile tetkik takip, rasyonel mutagenez ve yapısal biyoloji yaklaşımları tamamen kendini derleme mekanizması açıklığa kavuşturulması için yardımcı olabilir.
