В регенеративной медицине, надежный протокол дифференциации плюрипотентных стволовых клеток к определенному типу нервной клетки является ценным инструментом. В нашем случае, эти протоколы были очень полезны для изучения как развития глиобластомы и болезни Паркинсона. Итак, во-первых, генерация трехмерного органоида имеет то преимущество, что тесно имитирует физиологическое развитие, а также производство калиброванных по размеру нейросфер из плюрипотентных стволовых клеток имеет высокую воспроизводимость.
Следующую процедуру продемонстрирует Манон Локателли, аспирант нашей лаборатории. За 24 часа до начала трех-D культуры, заменить hESC среды с сывороткой свободной среде дополняется 10-микромоляной ингибитор ROCK. Клетки должны быть на 60%-м месте.
На следующий день отсоедините колонии HESC как одиночные клетки, удалив средний и полоскающий кальций и без магния PBS. Затем добавьте пять миллилитров раствора энзиматической растворения и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одной-двух минут. После этого соберите клетки в среде, свободной от сыворотки с 10-микромоляной ингибитором ROCK и центрифугой клеток при 300 раз g в течение пяти минут.
После центрифугации проверьте размер клеточной гранулы. Удалите супернатант и посчитайте клетки в 10 миллилитров среды, свободной от сыворотки, дополненной 10-микромолярным ингибитором ROCK. Параллельно промыть микроуровн пластины с двумя миллилитров сыворотки свободной среды на колодец и центрифуги пластины на 1, 200 раз г в течение пяти минут, чтобы удалить все пузырьки, с тем чтобы предотвратить образование нейросферы.
Затем приготовьте 28,2 миллиона клеток в 12,5 миллилитров среды без сыворотки, дополненной 10-микромоляным ингибитором ROCK. Выпределите 1000 клеток на микроуэлл. Центрифуга клетки в 300 раз г в течение пяти минут и проверить однородное повторное участие клеток в микроуровн пластины под микроскопом.
Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день изучите микроокровнную пластину, чтобы проверить размер сформированных сфер в каждом микроуровне. Перенесите сферы на шестиясную пластину, используя среду, дополненную коктейлем ингибирования двойного SMAD для содействия быстрой индукции нейронов.
С этого шага вперед, сферы культурны в вращении на 60 оборотов в минуту, чтобы предотвратить их от прилипания друг к другу или к пластине. На первый-четвертый день меняем среду каждые два-три дня перед выполнением нейронной индукции. С 4-го по 11-й день, способствовать распространению HESC полученных нейронных розеток, добавив EGF и bFGF на 10 нанограмм на миллилитр в B27 среды дополняется двойной SMAD коктейль.
С 11-го по 13-й день культуры сферы в среде B27 дополнены ингибитором BMP 0,5 микромоля. С 13 по 21 день, культура сферы в среде B27 дополняется GDNF и BDNF на 10 нанограмм на миллилитр и один микромолярный ингибитор гамма-секретазы. На 21 день поместите одну вставку пластины культуры в один колодец новой пластины из шести хорошо.
После этого добавьте один миллилитр среды B27, дополненный факторами роста и ингибиторами, к каждому хорошо под мембранной вставкой. Впоследствии пластины сфер на гидрофильной мембране PTFE откладываются на культурную пластину вставки и изменить среды каждые два-три дня в течение следующих трех недель дифференциации. Остановите вращение от этого шага.
Наличие розеток указывает на начало нейронной дифференциации. С 21 по 25 день культивируйте человеческие нервные органоиды в той же среде созревания нейронов. Затем, с 25 по 28 день, только дополняют B27 среды с одним микромоляной гамма-секретазы ингибитор.
С 28-го по 39-й день прекратите добавлять ингибитор гамма-секретазы и продолжайте нейрооноидную культуру человека только в среде B27. Через три недели нервные органоиды готовы к использованию для имплантации ГИК. На нулевом дне усиливают гЕУ в двух-D культуре до 60% стечения.
Затем замените среду стволовых клеток, используемую для поддержания плюрипотентности особенностей гЭСК с сывороткой свободной среды, содержащей двойной SMAD ингибирования коктейль, чтобы начать нейронной индукции и 10-микромоляры ROCK ингибитор для увеличения выживаемости клеток во время прохождения на следующий день. В первый день подготовьте микроокровую пластину с 2,5 миллилитров на колодец свободной от сыворотки среды, содержащей ту же концентрацию ингибитора ROCK и молекул ингибирования с двойным SMAD. Чтобы дифференцировать клетки к брюшной модели нервной трубки, добавьте SHH и FGF8 на 100 нанограмм на миллилитр и два микромолары сглаженный агонист.
После добавления среды, центрифуга пластины на 1200 раз г в течение пяти минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из микроуровн. После того, как пластина микроуэлла готова к использованию с половиной дифференциации среды, удалить среду hESCs и быстро мыть с кальцием и хлоридом магния свободной PBS. Разъединяйте колонии в одноклеточную подвеску, добавляя 7,5 миллилитров рекомбинантного энзиматичного раствора в колбу T75.
Инкубировать клетки в течение двух минут при 37 градусах по Цельсию, а затем добавить 7,5 миллилитров DMEM F12. Впоследствии соберите подвесную клетку и центрифугу по 300 раз г в течение пяти минут. Затем удалите супернатант и подсчитайте клетки в той же среде, используемой для подготовки пластины микроуэлла.
Отрегулируйте средний объем, чтобы получить подвеску клетки, позволяющую формировать нейросферы, содержащие 1000 клеток на микроуэлл, подготавлив 4,7 миллиона клеток в 2,5 миллилитров среды, и добавив его к предыдущим 2,5 миллилитров среднего уже помещены в пластину. Для того, чтобы правильно распределить клетки в каждом микроуэлле, аккуратно встряхните пластину и центрифуга ее в 300 раз г в течение пяти минут. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов для генерации сфер.
На второй день аккуратно промыть микроуэллы со средним и передать сферы в ткани обработанные шесть хорошо пластины. Поместите сферы в вращение при 37 градусах по Цельсию и измените половину среды со свежей средой каждые два-три дня. На третий-13-й день для усиления нервной индукции и преобразования в нервных прародителей с идентичностью среднего мозга, дополнить среду трехмимолярным ГСК-3-бета ингибитором.
Разделите образец на две новые обработанные тканями шести хорошо пластины, чтобы уменьшить плотность сферы и избежать агрегации сферы. На восьмой день начните созревание нейронов, переключившись на новую среду с факторами роста и меняйте среду каждые два-три дня. На 21-й день поместите одну культурную пластину в один колодец новой пластины из шести хорошо и добавьте 1,2 миллилитров нервной среды созревания, используемой для нейросферной дифференциации под мембранной вставкой.
Затем сместьте мембрану PTFE на вставку пластины культуры. Наконец, для создания нервного органоида, семян около 100 нейросфер в условиях воздушно-жидкого интерфейса на мембране PTFE. Остановите вращение от этого шага и меняй среду каждые два-три дня до тех пор, пока не будет достигнута требуемая точка времени дифференциации.
Вот схема стандартизированного протокола для генерации дофаминергических нервных органоидов. Иммунофторесценция анализ дофаминергических нервных органоидов показано на этих изображениях указывает на TH иммунореактивных клеток coexpressing Nurr1, среднего мозга конкретных маркера. Эти два графика представляют собой кинетику экспрессии генов TH и Nurr1, оцениваемую количественным RT-PCR.
Вот пример необработанных данных, записанных с платформы MEA. Каждый шип отображается вертикальной линией, в то время как оставшийся след - шум. И эта картина представляет собой нейросферу, отложенную на MEA.
Эти графики показывают суперпозицию типичных шипов, обнаруженных на основе необработанных данных. Черная смелая кривая указывает на среднее значение соответствующих красных кривых. Этот сюжет raster показывает отметки времени, связанные с каждым обнаруженным всплеском.
Различные цвета подчеркивают различные электроды. Эти протоколы позволяют исследователю ответить на вопрос о взаимодействии раковых клеток с нервной органоидной, а также прямой скрининг с дофаминергическим органоидом.
