Rejeneratif tıpta, pluripotent kök hücrelerin belirli bir nöral hücre tipine doğru farklılaşması için sağlam bir protokol değerli bir araçtır. Bizim olgumuzda, bu protokoller hem glioblastoma gelişimi hem de Parkinson hastalığını incelemek için çok yararlı oldu. Yani ilk olarak, üç boyutlu organoid üretimi fizyolojik gelişimi yakından taklit avantajına sahiptir, ve ayrıca pluripotent kök hücrelerden boyut kalibre nörosferüretimi yüksek tekrarlanabilirlik vardır.
Aşağıdaki prosedür Manon Locatelli, bizim laboratuvardan bir doktora öğrencisi tarafından gösterecektir. Üç Boyutlu kültüre başlamadan 24 saat önce hESC ortamını 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş serumsuz ortamla değiştirin. Hücreler %60 birleşmeyle olmalıdır.
Ertesi gün, orta kaldırarak ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulama hESC kolonileri tek hücre olarak ayırın. Daha sonra, enzimatik çözünme çözeltisi beş mililitre ekleyin ve bir ila iki dakika için 37 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, 10-mikromolar ROCK inhibitörü ile serumsuz ortamda hücreleri toplamak ve beş dakika boyunca 300 kez g hücreleri santrifüj.
Santrifüjden sonra hücre peletinin boyutunu kontrol edin. Supernatant çıkarın ve 10-mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen serum içermeyen orta 10 mililitre hücreleri saymak. Buna paralel olarak, mikrokuyu plakayı her kuyuda serumsuz iki mililitre ile durulayın ve nörosfer oluşumunu önlemek için tüm kabarcıkları çıkarmak için 1, 200 kez g beş dakika boyunca plakayı santrifüj edin.
Daha sonra, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen serumsuz orta 12,5 mililitre 28,2 milyon hücre hazırlamak. Mikrokuyu başına 1000 hücre dağıtın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve mikroskop altında mikrokuyu plakasındaki hücrelerin homojen olarak yeniden bölünmesini kontrol edin.
Tabağı gece boyunca 37 derecede kuvöze yerleştirin. Ertesi gün, her mikrokuyuda oluşan kürelerin boyutunu kontrol etmek için microwell plakasını inceleyin. Hızlı nöral indüksiyonu teşvik etmek için çift SMAD inhibisyonu kokteyli ile desteklenen ortamı kullanarak küreleri altı kuyulu bir tabağa aktarın.
Bu adımdan itibaren küreler, birbirine yapışmasını veya plakaya yapışmasını önlemek için 60 rpm'de rotasyonla kültürlenir. Birinci günden 4'e kadar, sinirsel indüksiyon yapmadan önce her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Dördüncü günden 11'e kadar, egf ve bFGF'yi mililitrebaşına 10 nanogramda, çift SMAD kokteyli ile desteklenen B27 ortamına ekleyerek hESC kaynaklı nöral rozetlerin çoğalmasını teşvik edin.
Gün 11-13, kültür B27 orta küreler 0.5 mikromolar BMP inhibitörü ile takviye. Gün 13-21, kültür B27 orta alanlarda GDNF ve BDNF mililitre başına 10 nanogram ve bir mikromolar gama-sekretaz inhibitörü ile desteklenmiştir. 21. günde, bir kültür plakasını yeni bir altı kuyuluk kuyununiçine yerleştirin.
Daha sonra, büyüme faktörleri ve inhibitörleri ile desteklenen bir mililitre B27 ortamı nı membran ucunun altındaki her bir kuyuya ekleyin. Daha sonra, bir kültür plakası eklemek üzerinde biriken bir hidrofilik PTFE membran küreler plaka ve farklılaşma aşağıdaki üç hafta boyunca her iki ila üç günde bir orta değiştirin. Bu adımdan döndürmeyi durdurun.
Rozetlerin varlığı sinirsel farklılaşmanın başlangıcını gösterir. 21.günden 25'e kadar, aynı sinirsel olgunlaşma ortamında insan sinir organoidleri yetiştirin. Sonra, gün 25-28, sadece bir mikromolar gama-sekreten inhibitörü ile B27 orta tamamlayıcı.
28.günden 39'a kadar gama salgı inhibitörlerini eklemeyi bırakın ve sadece B27'de insan nöral organoid kültürüne devam edin. Üç hafta sonra, nöral organoidler GIC implantasyonu için kullanıma hazırdır. Sıfır ın gününde, iki B kültüründeki hESC'leri %60'a kadar yükseltin.
Daha sonra, hESC'lerin pluripotency özelliklerini korumak için kullanılan kök hücre ortamını, ertesi gün geçiş sırasında hücrelerin sağkalım oranını artırmak için nöral indüksiyon ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü başlatmak için çift SMAD inhibisyonu kokteyli içeren serumsuz bir ortamla değiştirin. İlk gün, aynı ROCK inhibitörü ve çift SMAD inhibisyon molekülleri içeren serumsuz ortamın kuyusu başına 2,5 mililitre ile mikrokuyu plakasını hazırlayın. Nöral tüp ventral desen doğru hücreleri ayırt etmek için, mililitre başına 100 nanogram ve iki mikromolar agonist düzeltilmiş SHH ve FGF8 ekleyin.
Orta ekledikten sonra, mikrowells hava kabarcıkları kaldırmak için beş dakika boyunca 1, 200 kez g plaka santrifüj. Microwell plakayarı ayırt edici orta ile kullanıma hazır olduğunda, hESC'lerin ortasını çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum klorürsüz PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın. Bir T75 şişesine 7,5 mililitre rekombinant enzimatik çözelti ekleyerek kolonileri tek hücreli süspansiyona ayırın.
Hücreleri 37 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 7,5 mililitre DMEM F12 ekleyin. Daha sonra, hücre süspansiyon ve santrifüj toplamak 300 kez g beş dakika. Sonra, supernatant çıkarın ve microwell plaka hazırlamak için kullanılan aynı ortamda hücreleri saymak.
Orta hacmi, mikrowell başına 1,000 hücre içeren nöroküreler oluşturmak için bir hücre süspansiyon elde etmek için ayarlayın orta 2.5 mililitre içinde 4.7 milyon hücre hazırlayarak, ve zaten plaka yerleştirilen orta önceki 2.5 mililitre ekleyerek. Her mikrokuyudaki hücreleri doğru bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin. Daha sonra, küreler oluşturmak için 24 saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.
İkinci gün, mikro kuyuları hafifçe orta ile temizle ve küreleri doku yla tedavi edilen altı kuyuluk tabakta aktarın. Küreleri 37 santigrat derecede döndürün ve her iki ila üç günde bir temiz orta ile ortamın yarısını değiştirin. Gün üç ila 13, nöral indüksiyon geliştirmek ve bir orta beyin kimliği ile nöral atalara dönüştürmek için, üç mikromolar GSK-3-beta inhibitörü ile orta tamamlayın.
Küre yoğunluğunu azaltmak ve küre toplamaönlemek için iki yeni doku tedavi altı-iyi plakalar halinde örnek bölün. Sekizinci günde, büyüme faktörleri ile yeni ortama geçerek nöral olgunlaşmaya başlayın ve her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin. 21. günde, bir kültür plakasını yeni bir altı kuyulu plakanın bir kuyuya yerleştirin ve membran ucunun altına nörosfer farklılaşması için kullanılan 1,2 mililitre nöral olgunlaşma ortamı ekleyin.
Daha sonra, ptfe membranını bir kültür plakası ekleme sokuluüzerine yerleştirin. Son olarak, nöral organoid oluşturmak için, PTFE membran üzerinde hava-sıvı arayüz koşulları altında yaklaşık 100 nörosfer tohumu. Bu adımdan rotasyonu durdurun ve gerekli farklılaşma süresi elde edilene kadar her iki ila üç günde bir orta yı değiştirin.
Burada dopaminerjik nöral organoidlerin üretimi için standart bir protokol şeması. Bu görüntülerde gösterilen dopaminerjik nöral organoidlerin immünoresans analizi, orta beyne özgü bir belirteç olan Nurr1'i coexpressing TH immünoreaktif hücreleri gösterir. Bu iki grafik, nicel RT-PCR tarafından değerlendirilen TH ve Nurr1 gen ekspresyonunun kinetiklerini temsil eder.
Burada MEA platformu ile kaydedilen ham veri bir örnektir. Her başak dikey bir çizgi yle görüntülenirken, kalan iz gürültüdür. Ve bu resim MEA'da biriken bir nörosferi temsil eder.
Bu grafikler, ham verilerden algılanan tipik ani artışların süperpozisyonunu gösterir. Siyah kalın eğri, ilgili kırmızı eğrilerin ortalamasını gösterir. Bu raster arsa algılanan her başak ile ilişkili zaman damgaları gösterir.
Farklı renkler farklı elektrotları vurgular. Bu protokoller araştırmacı nöral organoid ile kanser hücresi etkileşimi hakkında soruya cevap yanı sıra dopaminerjik organoid ile doğrudan tarama sağlar.
