In der regenerativen Medizin ist ein robustes Protokoll zur Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu einem bestimmten neuronalen Zelltyp ein wertvolles Werkzeug. In unserem Fall waren diese Protokolle sehr nützlich, um sowohl die Entwicklung des Glioblastoms als auch die Parkinson-Krankheit zu untersuchen. So hat die Erzeugung von dreidimensionalem Organoid den Vorteil, die physiologische Entwicklung genau nachzuahmen, und auch die Produktion von größenkalibrierten Neurosphären aus pluripotenten Stammzellen hat eine hohe Reproduzierbarkeit.
Das folgende Verfahren wird von Manon Locatelli, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. 24 Stunden vor Beginn der Drei-D-Kultur das hESC-Medium durch ein serumfreies Medium ersetzen, das durch 10-Mikromolar-ROCK-Inhibitoren ergänzt wird. Die Zellen sollten bei 60% Konfluenz sein.
Am nächsten Tag lösen HESC-Kolonien als Einzelzellen, indem Sie das Medium entfernen und mit Kalzium und Magnesium-freiem PBS spülen. Dann fünf Milliliter enzymatische Auflösungslösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Minuten brüten. Danach sammeln Sie die Zellen in serumfreiem Medium mit 10-Mikromolaren-ROCK-Hemmer nummieren und zentrifugieren die Zellen fünf Minuten lang bei 300 mal g.
Überprüfen Sie nach der Zentrifugation die Größe des Zellpellets. Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen in 10 Milliliter serumfreies Medium, ergänzt durch 10-Mikromolar-ROCK-Hemmer. Parallel dazu spülen Sie die Mikrowellplatte mit zwei Millilitern serumfreiem Medium pro Brunnen ab und zentrifugieren Sie die Platte bei 1, 200 mal g für fünf Minuten, um alle Blasen zu entfernen, um neurosphärenförmige Bildung zu verhindern.
Als nächstes bereiten Sie 28,2 Millionen Zellen in 12,5 Milliliter serumfreies Medium auf, ergänzt durch 10-Mikromolar-ROCK-Hemmer. Geben Sie 1.000 Zellen pro Mikrowell. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 mal g und überprüfen Sie die homogene Neuaufteilung der Zellen in der Mikrowellplatte unter dem Mikroskop.
Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Mikrowell-Platte, um die Größe der gebildeten Kugeln in jedem Mikrobrunnen zu überprüfen. Übertragen Sie die Kugeln auf eine Sechs-Brunnen-Platte mit dem Medium mit Dual-SMAD-Hemmung seim Cocktail ergänzt, um eine schnelle neuronale Induktion zu fördern.
Von diesem Schritt nach vorn werden die Kugeln in Rotation bei 60 U/min kultiviert, um zu verhindern, dass sie zusammen oder an der Platte kleben. Am ersten bis vierten Tag das Medium alle zwei bis drei Tage ändern, bevor sie eine neuronale Induktion durchführen. Vom vierten bis elften Tag fördern Sie die Verbreitung von hESC-abgeleiteten neuronalen Rosetten, indem EGF und bFGF mit 10 Nanogramm pro Milliliter in das B27-Medium aufgenommen werden, ergänzt durch Dual-SMAD-Cocktail.
Vom 11. bis 13. Tag kulturiert die Sphären in B27 Medium mit 0,5 Mikromolar BMP-Hemmer ergänzt. Vom 13. bis 21. Tag kulturieren die Kugeln im B27-Medium mit GDNF und BDNF mit 10 Nanogramm pro Milliliter und einem Mikromolaren-Gamma-Sekrethemmer. Legen Sie am 21. Tag einen Kulturtellereinsatz in einen Brunnen einer neuen Sechs-Brunnen-Platte.
Danach, fügen Sie einen Milliliter B27 Medium mit Wachstumsfaktoren und Inhibitoren ergänzt, um jeden Bohrboden unter der Membraneinsatz. Anschließend die Kugeln auf einer hydrophilen PTFE-Membran auf einem Kulturplatteneinsatz ablagern und das Medium alle zwei bis drei Tage für die folgenden drei Wochen der Differenzierung ändern. Beenden Sie die Drehung von diesem Schritt aus.
Das Vorhandensein von Rosetten deutet auf die Einleitung der neuronalen Differenzierung hin. Vom 21. bis 25. Tag kultivieren sie menschliche neurale Organoide im selben neuronalen Reifungsmedium. Dann, vom 25. bis 28. Tag, nur b27 Medium mit einem mikromolaren Gamma-Sekrese-Inhibitor ergänzen.
Vom 28. bis 39. Tag, beenden Sie die Zugabe der Gamma-Sekretase-Hemmer und setzen Sie die menschliche neuronale Organoid-Kultur nur in B27 Medium. Nach drei Wochen sind neuronale Organoide bereit für die GIC-Implantation. Am Tag Null, verstärken hESCs in Zwei-D-Kultur bis zu 60%Konfluenz.
Ersetzen Sie dann das Stammzellmedium, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenzvon hESCs verwendet wird, durch ein serumfreies Medium, das einen Dual-SMAD-Hemmungscocktail enthält, um die neuronale Induktion und den 10-Mikromolaren-ROCK-Inhibitor zu starten, um die Überlebensrate der Zellen während der Passage am nächsten Tag zu erhöhen. Bereiten Sie am ersten Tag die Mikrowellplatte mit 2,5 Millilitern pro Brunnen serumfreies Medium vor, das die gleiche Konzentration an ROCK-Hemmern und Dual-SMAD-Hemmungsmolekülen enthält. Um Zellen in Richtung des neuralröhrenen ventralen Musters zu unterscheiden, fügen Sie SHH und FGF8 mit 100 Nanogramm pro Milliliter hinzu und zwei Mikromolaren glätten den Agonisten.
Nach Zugabe des Mediums zentrieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1,200 mal g, um Luftblasen aus den Mikrobrunnen zu entfernen. Sobald die Mikrowell-Platte bereit ist, mit halb differenzierendem Medium zu verwenden, entfernen Sie das Medium von hESCs und waschen Sie schnell mit Calcium- und Magnesiumchlorid-freien PBS. Dissoziieren Sie die Kolonien in eine einzellige Suspension, indem Sie 7,5 Milliliter rekombinanter enzymatischer Lösung in einem T75-Kolben hinzufügen.
Inkubieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann 7,5 Milliliter DMEM F12 hinzu. Anschließend die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten sammeln. Entfernen Sie dann den Überstand und zählen Sie die Zellen in demselben Medium, das zur Herstellung der Mikrowellplatte verwendet wird.
Passen Sie das mittlere Volumen an, um eine Zellsuspension zu erhalten, die es ermöglicht, Neurosphären mit 1.000 Zellen pro Mikrowell zu bilden, indem Sie 4,7 Millionen Zellen in 2,5 Milliliter n. Medium vorbereiten und zu den vorherigen 2,5 Millilitern Medium hinzufügen, das bereits in der Platte platziert wurde. Um die Zellen in jedem Mikrobrunnen richtig zu verteilen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 mal g. Als nächstes inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden, um Kugeln zu erzeugen.
Am zweiten Tag die Mikrobrunnen vorsichtig mit Medium spülen und die Kugeln in eine gewebebehandelte Sechs-Brunnen-Platte übertragen. Stellen Sie die Kugeln bei 37 Grad Celsius in Rotation und wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des Mediums mit frischem Medium. Am Tag drei bis 13, um die neuronale Induktion zu verbessern und in neuronale Vorläufer mit einer Midbrain-Identität umzuwandeln, ergänzen Sie das Medium mit dreimikromolaren GSK-3-Beta-Hemmern.
Teilen Sie die Probe in zwei neue gewebebehandelte Sechs-Bohr-Platten auf, um die Kugeldichte zu reduzieren und eine Kugelaggregation zu vermeiden. Beginnen Sie am achten Tag die neuronale Reifung, indem Sie mit Wachstumsfaktoren auf ein neues Medium umschalten und das Medium alle zwei bis drei Tage verändern. Legen Sie am 21. Tag einen Kulturplatteneinsatz in einen Brunnen einer neuen Sechs-Brunnen-Platte und fügen Sie 1,2 Milliliter neuronales Reifungsmedium hinzu, das für die Neurosphärendifferenzierung unter dem Membraneinsatz verwendet wird.
Setzen Sie dann die PTFE-Membran auf einen Kulturplatteneinsatz ab. Schließlich, um das neuronale Organoid zu erzeugen, säen rund 100 Neurosphären unter luft-flüssigen Grenzbedingungen auf der PTFE-Membran. Beenden Sie die Rotation von diesem Schritt und ändern Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis der erforderliche Differenzierungszeitpunkt erreicht ist.
Hier ist ein Schema eines standardisierten Protokolls für die Erzeugung von dopaminergen neuralen Organoiden. Die in diesen Bildern gezeigte Immunfluoreszenzanalyse von dopaminergen neuralen Organoiden zeigt TH-Immunreaktive Zellen, die Nurr1, einen Midbrain-spezifischen Marker, koexzieren. Diese beiden Graphen stellen die Kinetik der TH- und Nurr1-Genexpression dar, die von quantitativer RT-PCR ausgewertet wird.
Hier ist ein Beispiel für Rohdaten, die mit der MEA-Plattform aufgezeichnet wurden. Jede Spitze wird durch eine vertikale Linie angezeigt, während die verbleibende Spur Rauschen ist. Und dieses Bild stellt eine Neurosphäre dar, die sich auf dem MEA ablagert.
Diese Diagramme zeigen die Überlagerung typischer Spitzen, die aus den Rohdaten erkannt wurden. Die schwarze Fettkurve gibt den Durchschnitt der entsprechenden roten Kurven an. Dieses Raster-Plot zeigt die Zeitstempel, die jeder erkannten Spitze zugeordnet sind.
Die verschiedenen Farben heben die verschiedenen Elektroden hervor. Diese Protokolle ermöglichen es Forschern, Fragen über krebszellige Interaktion mit neuronalen Organoid sowie direktes Screening mit dopaminergen Organoid zu beantworten.
