재생 의학에서, 특정 신경 세포 유형을 향해 다능성 줄기 세포의 분화의 강력한 프로토콜은 귀중한 도구입니다. 우리의 경우에, 이 프로토콜은 교모세포종 발달과 파킨슨 병을 둘 다 공부하는 것이 아주 유용했습니다. 먼저, 3차원 오르가노이드의 생성은 생리학적 발달을 면밀히 모방하는 장점이 있으며, 또한 만능 줄기 세포로부터의 크기 보정 된 신경구의 생산은 높은 재현성을 갖는다.
다음 절차는 마논 Locatelli에 의해 설명 됩니다., 우리의 실험실에서 박사 과정 학생. 3-D 배양을 시작하기 24시간 전에 hESC 배지를 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충한 혈청 이없는 배지로 교체한다. 세포는 60%의 합류에 있어야 합니다.
다음 날, 중간을 제거하고 칼슘과 마그네슘이없는 PBS로 헹구어 단일 세포로 hESC 식민지를 분리합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 효소 용해 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 1~2분 동안 배양합니다. 그 후, 10 마이크로몰러 ROCK 억제제와 혈청 없는 배지에서 세포를 수집하고 5분 동안 300배 g로 세포를 원심분리한다.
원심 분리 후, 세포 펠릿의 크기를 확인합니다. 상체를 제거하고 10 마이크로 몰러 ROCK 억제제로 보충 된 혈청없는 배지의 10 밀리리터에서 세포를 계산합니다. 동시에, 마이크로웰 플레이트를 우물당 혈청 이없는 배지 2밀리리터로 헹구고, 5분간 1, 200배 g에서 플레이트를 원심분리하여 신경구 형성을 방지합니다.
다음으로, 10 마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충된 혈청 없는 배지의 12.5 밀리리터에서 2,820만 개의 세포를 준비한다. 마이크로웰 당 1, 000 세포를 분배합니다. 원심 분리는 5 분 동안 300 배 g에서 세포를 원심분리하고 현미경의 밑에 마이크로웰 플레이트에 있는 세포의 균질한 재분할을 확인합니다.
하룻밤 사이에 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날, 마이크로웰 플레이트를 검사하여 각 마이크로웰에서 형성된 구체의 크기를 확인합니다. 빠른 신경 유도를 촉진하기 위해 이중 SMAD 억제 칵테일로 보충 된 매체를 사용하여 6 웰 플레이트로 구체를 옮기.
이 단계에서 구체는 60 rpm에서 회전하여 함께 또는 플레이트에 달라붙지 않도록 배양됩니다. 1~4일째에는 신경 유도를 수행하기 전에 2~3일마다 배지를 변경합니다. 4일부터 11일까지, 이중 SMAD 칵테일로 보충된 B27 배지에 밀리리터당 10 나노그램에 EGF및 bFGF를 추가하여 hESC 유래 신경 장미의 증식을 촉진합니다.
11일부터 13일까지, B27 배지의 구체를 0.5 마이크로몰라 BMP 억제제로 보충하였다. 13일부터 21일까지, B27 배지의 구체를 밀리리터당 10나노그램과 1개의 마이크로몰라 감마 분비 억제제로 보충하였다. 21일, 새로운 6웰 플레이트의 한 웰에 배양판 인서트를 한 개 놓습니다.
그 후, 성장 인자와 억제제로 보충 B27 배지의 1 밀리 리터를 추가 멤브레인 삽입 아래 각 잘. 이어서, 배양판 삽입에 증착된 친수성 PTFE 멤브레인상에 구체를 플레이트하고 다음 3주간분분동안 매2~3일마다 배지를 변경한다. 이 단계에서 회전을 중지합니다.
로제트의 존재는 신경 분화의 개시를 나타냅니다. 21일부터 25일까지, 동일한 신경 성숙 배지에서 인간 신경 오르가노이드를 육성한다. 그런 다음, 25일에서 28일째까지, 하나의 마이크로몰라 감마 분비 억제제로 B27 배지만 보완한다.
28일부터 39일까지, 감마-분비억제제 첨가를 중단하고 B27 배지에서만 인간 신경 오르가노이드 배양을 지속한다. 3 주 후, 신경 오르가노이드는 GIC 이식에 사용할 준비가되어 있습니다. 0일째에는 최대 60%의 컨플루언스(2D 문화)로 hESC를 증폭시합니다.
이어서, hESC의 흉부 특징을 유지하는 데 사용되는 줄기세포 배지를 이중-SMAD 억제 칵테일을 함유한 혈청 없는 배지로 교체하여 다음 날 통과 시 세포의 생존율을 높이기 위해 신경 유도 및 10마이크로몰러 ROCK 억제제를 시작한다. 첫날에는 ROCK 억제제와 이중 SMAD 억제 분자의 농도를 포함하는 혈청이 없는 배지당 2.5 밀리리터로 마이크로웰 플레이트를 준비합니다. 신경관 복부 패턴을 향해 세포를 분화하기 위하여는, 밀리리터 당 100 나노그램에 SHH와 FGF8를 추가하고 2개의 micromolars는 고뇌를 부드럽게 합니다.
매체를 추가한 후, 마이크로웰에서 기포를 제거하기 위해 5분 동안 1, 200배 g의 플레이트원심분리기. 마이크로웰 플레이트가 반 분화 매체와 함께 사용할 준비가 되면 hESC의 매체를 제거하고 칼슘과 염화 마그네슘이없는 PBS로 신속하게 세척하십시오. T75 플라스크에 재조합 효소 용액7.5 밀리리터를 추가하여 식민지를 단일 셀 서스펜션으로 분리합니다.
섭씨 37도에서 2분 동안 세포를 배양한 다음 DMEM F12의 7.5 밀리리터를 추가합니다. 이어서, 세포 현탁액과 원심분리기를 5분 동안 300배 g에서 수집한다. 그런 다음, 상체를 제거하고 마이크로웰 플레이트를 준비하는 데 사용되는 동일한 배지에서 세포를 계산한다.
중간 부피를 조절하여 마이크로웰당 1, 000세포를 함유한 신경구를 형성할 수 있도록 하는 세포 현피를 구하여 2.5밀리리터의 배지에 470만 개의 세포를 준비하고, 이미 플레이트에 배치된 배지의 2.5밀리리터에 첨가한다. 각 마이크로웰에 세포를 올바르게 분배하기 위해 접시를 부드럽게 흔들고 원심분리기를 5분 동안 300배 g로 흔들어 줍니다. 다음으로, 구체를 생성하기 위해 24 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
둘째 날, 마이크로웰을 중간 크기로 부드럽게 세척하고 조직 처리된 6웰 플레이트에서 구체를 이송합니다. 구체를 섭씨 37도로 회전시키고 2~3일마다 중간 을 반으로 변경합니다. 셋째 날에서 13일, 신경 유도를 강화하고 중뇌 정체성을 가진 신경 전구체로 변환하기 위해, 3 마이크로 몰러 GSK-3 베타 억제제로 배지를 보충한다.
샘플을 두 개의 새로운 조직 처리 6웰 플레이트로 분할하여 구밀도를 줄이고 구체 응집을 피합니다. 8일째에는 성장인자를 가진 새로운 매체로 전환하여 신경 성숙을 시작하고 2~3일마다 배지를 변경합니다. 21일, 새로운 6웰 플레이트 의 한 웰에 1개의 배양판 인서트를 넣고 멤브레인 삽입 아래에 신경권 분화에 사용되는 신경 성숙 배지 1.2 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 배양 판 삽입시 PTFE 멤브레인을 제거합니다. 마지막으로, 신경 오르가노이드를 생성하기 위해 PTFE 멤브레인의 공기 -액체 인터페이스 조건 하에서 약 100 개의 신경 구체를 시드하십시오. 이 단계에서 회전을 중지하고 필요한 분화 시점이 달성 될 때까지 매 2 ~ 3 일마다 매체를 변경합니다.
다음은 도파민제 신경 오르가노이드 생성을 위한 표준화된 프로토콜의 회로도입니다. 이러한 이미지에 나타난 도파민성 신경 오르가노이드의 면역 형광 분석은 중뇌 특이적 마커인 Nurr1을 공동 발현하는 TH 면역 반응성 세포를 나타낸다. 이 두 그래프는 정량적 RT-PCR에 의해 평가된 TH 및 Nurr1 유전자 발현의 역학을 나타낸다.
다음은 MEA 플랫폼에 기록된 원시 데이터의 예입니다. 각 스파이크는 세로 선으로 표시되는 반면 나머지 추적은 노이즈입니다. 그리고이 그림은 MEA에 증착 된 신경 구체를 나타냅니다.
이러한 그래프는 원시 데이터에서 감지된 일반적인 스파이크의 중첩을 보여 준다. 검정 굵은 곡선은 해당 빨간색 곡선의 평균을 나타냅니다. 이 래스터 플롯은 감지된 각 스파이크와 관련된 타임 스탬프를 보여 주습니다.
다른 색상은 다른 전극을 강조 표시합니다. 이 프로토콜은 연구원이 신경 오르가노이드와의 암 세포 상호 작용에 대한 질문뿐만 아니라 도파민 성 오르가노이드와의 직접 스크리닝에 대한 질문에 대답 할 수 있게합니다.
