في الطب التجديدي، بروتوكول قوي للتمايز من الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو نوع خلية عصبية محددة هو أداة قيمة. في حالتنا، كانت هذه البروتوكولات مفيدة جدا لدراسة كل من تطوير الورم الأرومي الدبقي ومرض باركنسون. لذا أولاً، إن توليد الأعضاء ثلاثية الأبعاد له ميزة محاكاة التطور الفسيولوجي عن كثب، وأيضاً إنتاج الخلايا العصبية معايرة بالحجم من الخلايا الجذعية متعددة القدرات له قابلية عالية للتكرار.
الإجراء التالي سوف يظهر من قبل مانون Locatelli، طالب دكتوراه من مختبرنا. قبل 24 ساعة من بدء ثقافة ثلاثية الأبعاد، استبدل وسيط hESC بوسيلة خالية من المصل مكمّلة بمثبطات روك 10 ميكرومولار. يجب أن تكون الخلايا في 60٪ التقاء.
في اليوم التالي، فصل مستعمرات hESC كخلايا مفردة عن طريق إزالة المتوسطة والشطف مع برنامج تلفزيوني خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من حل الانزيمية واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك، جمع الخلايا في المتوسطة خالية من المصل مع 10 ميكرومولار روك المانع والطرد المركزي الخلايا في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، والتحقق من حجم بيليه الخلية. إزالة ناظر عد الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسطة خالية من المصل تستكمل مع مثبط الصخور الدقيقة 10. في موازاة ذلك، شطف لوحة ميكروويل مع ملليلتر اثنين من المتوسطة خالية من المصل في البئر والطرد المركزي لوحة في 1، 200 مرة ز لمدة خمس دقائق لإزالة جميع الفقاعات من أجل منع تكوين الغلاف العصبي.
المقبل, إعداد 28.2 مليون خلية في 12.5 ملليلتر من المصل خالية المتوسطة تستكمل مع مثبط الصخور 10 ميكرومولار. الاستغناء 1000 خلية لكل ميكروويل. الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق والتحقق من إعادة تقسيم متجانسة من الخلايا في لوحة microwell تحت المجهر.
ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، افحص لوحة المايكروويل للتحقق من حجم المجالات المشكلة في كل ميكروويل. نقل المجالات إلى لوحة ستة-جيدا باستخدام المتوسطة تستكمل مع ثنائي SMAD تثبيط كوكتيل لتعزيز الحث العصبية السريعة.
من هذه الخطوة إلى الأمام، يتم استزراع المجالات بالتناوب عند 60 دورة في الدقيقة لمنعها من التمسك معا أو إلى لوحة. في اليوم الأول إلى الرابع، قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام قبل إجراء الحث العصبي. من اليوم الرابع إلى الحادي عشر، تعزيز انتشار الورود العصبية المستمدة من hESC عن طريق إضافة EGF وbFGF في 10 نانوغرام لكل ملليلتر إلى B27 المتوسطة تكملها مع كوكتيل SMAD مزدوجة.
من يوم 11 إلى 13، والثقافة المجالات في B27 المتوسطة تكمل مع مثبطات BMP 0.5 ميكرومولار. من يوم 13 إلى 21، والثقافة المجالات في B27 المتوسطة تكمل مع GDNF و BDNF في 10 نانوغرام لكل ملليلتر ومثبط واحد ميكرومولار غاما-سيكرياز. في اليوم 21، ضع لوحة ثقافة واحدة في بئر واحد من لوحة جديدة من ستة بئر.
بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من B27 المتوسطة تكملها عوامل النمو ومثبطات لكل بئر تحت الغشاء إدراج. في وقت لاحق، لوحة المجالات على غشاء PTFE هيدروفيلي المودعة على لوحة ثقافة إدراج وتغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة ثلاثة أسابيع التالية من التمايز. إيقاف التدوير من هذه الخطوة.
وجود الورود يشير إلى بدء التمايز العصبي. من اليوم 21 إلى 25، زراعة الأعضاء العصبية البشرية في نفس المتوسطة النضج العصبي. ثم، من اليوم 25 إلى 28، تكمل فقط B27 المتوسطة مع مثبطات أشعة غاما-سيكرياز ميكرومولار واحد.
من اليوم 28 إلى 39، والتوقف عن إضافة مثبطات غاما-سيكرياز ومواصلة الثقافة الجهازية العصبية البشرية في B27 المتوسطة فقط. بعد ثلاثة أسابيع، تكون الأجهزة العصبية جاهزة للاستخدام في زراعة GIC. في اليوم صفر، تضخيم hESCs في ثقافة 2-D تصل إلى 60٪ التقاء.
ثم، استبدال المتوسطة الخلية الجذعية المستخدمة للحفاظ على ميزات متعددة القدرات من hESCs مع المتوسطة خالية من المصل تحتوي على ثنائي SMAD تثبين كوكتيل لبدء الحث العصبي ومثبط الصخور 10 ميكرومولار لزيادة معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا أثناء مرور في اليوم التالي. في اليوم الأول، قم بإعداد لوحة المايكروويل مع 2.5 ملليلتر لكل بئر من المتوسطة الخالية من المصل التي تحتوي على نفس تركيز مثبطات روك وجزيئات تثبيط SMAD المزدوجة. لتمييز الخلايا نحو نمط الأنبوب البطني العصبي، أضف SHH و FGF8 بمعدل 100 نانوغرام لكل ملليلتر واثنين من ميكروموللارات ممهدة.
بعد إضافة المتوسطة، الطرد المركزي لوحة في 1، 200 مرة ز لمدة خمس دقائق لإزالة فقاعات الهواء من microwells. مرة واحدة في لوحة microwell جاهز للاستخدام مع نصف وسيط التمييز، وإزالة المتوسطة من hESCs وغسل بسرعة مع الكالسيوم والمغنيسيوم كلوريد خالية من برنامج تلفزيوني. افصل المستعمرات إلى تعليق أحادي الخلية عن طريق إضافة 7.5 ملليلتر من محلول الأنزيمي المؤتلف في قارورة T75.
احتضان الخلايا لمدة دقيقتين في 37 درجة مئوية ثم إضافة 7.5 ملليلتر من DMEM F12. وفي وقت لاحق، قم بجمع نظام التعليق الخلوي والطرد المركزي بمعدل 300 مرة من g لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة فائقة العد الخلايا في نفس الواسطة المستخدمة لإعداد لوحة microwell.
ضبط حجم متوسط للحصول على تعليق الخلية السماح لتشكيل الخلايا العصبية التي تحتوي على 1000 خلية لكل ميكروويل عن طريق إعداد 4.7 مليون خلية في 2.5 ملليلتر من المتوسط، وإضافته إلى 2.5 ملليلتر السابقة من المتوسطة وضعت بالفعل في لوحة. من أجل توزيع الخلايا بشكل صحيح في كل microwell، يهز بلطف لوحة والطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتوليد المجالات.
في اليوم الثاني، اغسل الميكويلات بلطف مع المتوسطة ونقل المجالات في طبق سداسي جيد يعالج بالأنسجة. ضع الأوساط في دوران عند 37 درجة مئوية وتغيير نصف المتوسط مع المتوسطة الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم الثالث إلى الثالث عشر، لتعزيز الحث العصبي وتحويله إلى ذريات عصبية مع هوية منتصف العمر، تكمل المتوسطة مع مثبطات GSK-3-بيتا ثلاثية الصغر.
تقسيم العينة إلى اثنين من الأنسجة الجديدة المعالجة ستة آبار لوحات للحد من كثافة المجال وتجنب تجميع الكرة. في اليوم الثامن، ابدأ النضج العصبي من خلال التحول إلى وسيط جديد مع عوامل النمو وتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم 21، ضع لوحة ثقافية واحدة في بئر واحدة من لوحة جديدة من ستة آبار وأضف 1.2 ملليلتر من وسيط النضج العصبي المستخدم لتمايز الغلاف العصبي تحت إدراج الغشاء.
ثم، خلع غشاء PTFE على إدراج لوحة الثقافة. وأخيرا، لتوليد الجهاز العصبي، بذور حوالي 100 neurospheres تحت ظروف واجهة الهواء السائل على غشاء PTFE. وقف التناوب من هذه الخطوة وتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم تحقيق نقطة التمايز المطلوبة.
هنا هو مخطط بروتوكول موحد لتوليد organoids العصبية الدوبامين. تحليل المناعة من organoidoids العصبية الدوباميني هو مبين في هذه الصور يشير إلى TH الخلايا النشطة المناعية coexpressing Nurr1، علامة متوسطة محددة. هذان الرسمان البيانيان يمثلان حركية التعبير الجيني TH و Nurr1 الذي تم تقييمه بواسطة الـ RT-PCR الكمي.
هنا مثال على البيانات الخام المسجلة مع منصة MEA. يتم عرض كل ارتفاع بواسطة خط عمودي بينما التتبع المتبقي هو الضوضاء. وهذه الصورة تمثل طبقة عصبية مودعة على MEA.
تُظهر هذه الرسوم البيانية تراكب المسامير النموذجية التي تم اكتشافها من البيانات الأولية. يشير المنحنى الأسود العريض إلى متوسط المنحنيات الحمراء المقابلة. تُظهر هذه القطعة النقطية الطوابع الزمنية المقترنة بكل ارتفاع تم اكتشافه.
ألوان مختلفة تسليط الضوء على مختلف الأقطاب الكهربائية. هذه البروتوكولات تسمح للباحث للإجابة على سؤال حول تفاعل الخلايا السرطانية مع الجهاز العصبي وكذلك الفحص المباشر مع الأعضاء الدوبامين.
