소장 점막의 인트라바이탈 현미경 검사는 다른 면역 세포 유형 사이의 상피 내에서 세포 상호 작용의 현물 역학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 또는이 두 구획 사이. 이 기술의 주요 장점은 장 점막 내에서 실시간으로 고속 및 고해상도 이미지를 획득 할 수 있다는 것입니다. 장의 라이브 이미징은 세포 상호 작용, 또는 점막 면역, 상피 생물학 또는 암 생물학에 관여하는 세포 신호에 대한 추가 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이것은 수술 기술의 연습뿐만 아니라 이미지 수집을위한 마우스의 인내및 최적의 위치 가필요한 도전적인 방법입니다. 마취형 형질성 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP, 감마 델타 T 세포 수용체를 표현한 후, 새로 준비된 Hoechst 33342 염료 용액200마이크로리터를 천천히 주입하기 위해 결핵 주사기를 사용합니다. 주사 후 1~2분 후에 동물의 눈에 연고를 발라 건조를 방지합니다.
그런 다음, 피부와 복막을 통해 2CM 수직 절개를 하고, 하복부의 중간선을 따라 각진 집게를 사용하여 복막 구멍에서 케이쿰을 조심스럽게 끌어냅니다. 최소한의 배설물을 함유한 소장의 2-3CM 영역을 식별하고, 장간 혈관을 찢지 않도록 주의하고, 자궁과 소장을 복막 구멍으로 조심스럽게 반환하여 관심 의 세그먼트를 외부화시켰다. 혈관 사이의 밑줄 막질의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고 집게 끝을 부드럽게 문지르면 막에 구멍을 만듭니다.
각진 집게와 5CM 봉합사에 부착된 곡선 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여, 멤브레인의 구멍을 통해 회막의 한쪽을 관통하고, 하중 안대기의 반대편을 통해 위로 침투하고, 한 봉합사를 상단에 배치하고, 다른 하나는 절개 하부 근처에 배치하여 절개 의 루프를 유지하면서 외부화하였다. 성공가능성을 높이기 위해 복부 봉합사를 배치하면서 혈관을 묶거나 찢어버리지 말고 장의 불필요한 취급을 제한하십시오. 그런 다음, 같은 방식으로 장 루프 아래 의 피부를 닫고, 밑줄 복막에서 이전 봉합사 사이의 절개 중간에 하나의 봉합사를 배치합니다.
전기 카우테리를 사용하여, 시간 발생 경계를 따라 천공의 라인을 확인하고 즉시 추가 열 유도 조직 손상을 방지하기 위해 장의 표면에 물 몇 방울을 적용합니다. 잔류물을 제거하기 위해 김스 와이프와 블롯. 바나 가위를 사용하여 소작 된 조직의 탈면 가장자리에서 약 1.5CM 수평 슬릿을 잘라 내고, 소작 라인의 길이를 따라 외부 조직 세그먼트의 근접 단부를 향해 절단하십시오.
점막 표면이 노출되면, 습한 김와이프로 복부를 덮어 조직을 수분을 유지합니다. 회전 디스크 공초점 현미경 이미징의 경우, 덮여 혈관의 현미경으로 마우스를 수송. 이미징 소프트웨어를 실행하고 현미경의 머리를 다시 기울이고 1 마이크로 몰라 벼룩 알렉사 플루어 염료와 행크의 버퍼링 식염수 용액150 마이크로 리터를 유리 커버의 미끄러진 바닥에 추가합니다.
열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿을 수 있도록 마우스를 배치합니다. 미리 데워진 인큐베이터에 마우스와 접시를 이미징 단계에 놓습니다. 각 레이저의 흥분 강도 및 노출 시간을 각각 10-15 밀리와트 및 120-150 밀리초 이하로 설정하고 프레임 평균을 2로 조정합니다.
전자곱게인 함수를 켜면 배경 노이즈를 줄이고 63X 목표 교정을 선택하여 픽셀 크기를 올바르게 측정합니다. 405 나노미터 레이저와 20X 공기 목표를 사용하여 핵을 수동으로 시각화하여 눈에 띄는 움직임이나 표류가 부족한 사악한 필드를 찾아 호흡, 연반 또는 심장 박동으로 인한 관절 운동 영역을 피합니다. X-Y 스캔을 사용하여 관심 분야의 X-Y 좌표를 기록하고 글리세롤 침지 63X 목표로 전환합니다.
405나노미터 채널에서 최대 1분간 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 빌리가 안정되어 있는지 확인하고, 초점을 조정하여 villus 팁 바로 아래에 직교 평면을 찾습니다. 그런 다음 1.5 마이크로미터 단계를 사용하여 핵을 해결하기 어려울 때까지 약 15-20 마이크로미터에서 빌루스까지 약 15-20 마이크로미터에서 시작하여 z-스택을 획득합니다. 인수를 시작한 후 3-5분 후, 이미지 안정성과 감마 델타 내피성 세포 운동성을 확인하고, 각 빌드 필드에 대해 30-60분 동안 이미지를 계속 수집합니다.
감마 델타 내 림프구는 동적 감시 행동을 나타내며, 지하 막을 따라 연구 상태에서 측면 세포 간 공간으로 이동하여 상피를 순찰합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, 컬러 트랙은 30분 동안 개별 감마 델타 내 림프구의 철새 경로를 나타냅니다. 측측 세포간 공간에서 의 상피 림프구의 빈도가 항-인터류키-2 수용체 베타 항체로 처리된 마우스에서 증가되었지만, 이러한 감마 델타 내성 림프구의 30% 이상이 공회전 동작을 나타냈다.
이러한 공회전 표현형은 감마델타 내상피성 림프구의 즉각적인 속도와 감금 비율 모두에서 현저한 감소에 의해 확인되었다. 또한, 유휴 감마 델타 내 림프구는 더 오래 거주했고, 모틸감마 델타 내 림프구에 비해 측면 세포 간 공간 내에서 더 자주 국한되었다. 연동으로 인해 과도한 움직임이 부족한 사악한 분야를 식별하기 어려울 수 있습니다.
마우스 위치를 재배치하면 보다 안정적인 필드를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 셀 트래킹 데이터의 추가 분석은 특정 운동성 동작을 식별하거나 세포 상호 작용을 측정하기 위한 추가 메트릭을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. IEL-motility의 인트라바이탈 이미징 및 분석은 타고난 면역 신호가 감마 델타 IEL 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 통찰력을 제공하는 IEL 기능의 표준 판독이 되었습니다.
