Интравитальная микроскопия мелкой слизистой оболочки кишечника может дать представление о апатитотемпоральной динамике клеточных взаимодействий внутри эпителия между различными типами иммунных клеток, или между этими двумя отсеками. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет получать высокоскоростные изображения и изображения высокого разрешения в слизистой оболочке кишечника в режиме реального времени. Live изображения кишечника может обеспечить дополнительное понимание клеточных взаимодействий, или клеточной сигнализации, участвующих в слизистой иммунитет, эпителиальной биологии или биологии рака.
Это сложный метод, который требует практики хирургической техники, а также терпения и оптимального позиционирования мыши для получения изображений. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша в анестезируемой трансгенной мыши, выражая расширенный зеленый флуоресцентный белок, или EGFP, Гамма-дельта Т-клеточный рецептор, использовать туберкулин шприц медленно вводить 200 микролитров свежеприготовленного Hoechst 33342 красителя решение в ретро-орбитальной венозной пазухи. Через одну-две минуты после инъекции нанесите мазь на глаза животного, чтобы предотвратить высыхание.
Затем сделайте вертикальный разрез 2CM через кожу и брюшную полость, вдоль средней линии нижней части живота и используйте угловые типсы, чтобы тщательно вытащить кекум из брюшной полости. Определите 2-3CM области тонкой кишки, которая содержит минимальное содержание фекалий, заботясь, чтобы не разорвать мезентерионные кровеносные сосуды, и тщательно вернуть caecum и оставшиеся тонкой кишки в брюшной полости, в результате чего сегмент интереса экстернализированы. Размещение двух пар типсов по обе стороны от подчеркнуть мезентерии между кровеносными сосудами, осторожно руб кончики типсов вместе, чтобы создать отверстие в мембране.
Используя угловые типсы и изогнутую конусно-тольную иглу, прикрепленную к шову 5CM, проникайте в одну сторону перитонеума через отверстие в мембране, а вверх через другую сторону перитонеальной подкладки, помещая одну шов сверху, а другую в нижней части разреза, чтобы закрыть разрез, сохраняя при этом петлю кишечника. Чтобы увеличить вероятность успеха, не связывать или рвать кровеносные сосуды при размещении брюшной шов и ограничить любые посторонние обработки кишечника. Затем, закрыть кожу под кишечной петли таким же образом, поместив один шов в середине разреза между предыдущими швами в подчеркнуть брюшной полости.
Используя электрокаутерию, сделайте линию перфорации вдоль антаймэнтерической границы и немедленно нанесите несколько капель воды на поверхность кишечника, чтобы предотвратить дополнительные повреждения тканей, вызванных теплом. Пятно с кимвипе, чтобы удалить остаточную воду. Используйте ножницы Vanna, чтобы сократить примерно 1.5CM горизонтальной щели на дистальной кромке прижигаемой ткани, по длине прижигаемой линии, к проксимальной конце экстернализованной ткани сегмента.
Когда слизистая поверхность подвергается, покрыть живот с влажной кимвипе держать ткани гидратированных. Для спиннинга диска конфокальные микроскопии изображения, транспортировать мышь к микроскопу в покрытый сосуд. Запустите программное обеспечение для визуализации и наклоните голову микроскопа назад, и добавьте 150 микролитров 1 микромолярной блохи Alexa Fluor красителя и Hank's Buffered Saline Solution на поскользнулся дно стеклянной крышки.
Распоимите мышь так, чтобы открытая слизистая поверхность напрямую контакты с крышкой. Поместите мышь и блюдо на сцену визуализации в предварительно разогретом инкубаторе. Установите интенсивность возбуждения и время экспозиции для каждого лазера не более чем на 10-15 милливатт и 120-150 миллисекунд, соответственно, и отрегулируйте средний размер кадра до 2.
Включите функцию Electron-Multiplying Gain, чтобы уменьшить фоновый шум и выбрать объективную калибровку 63X для обеспечения правильного измерения размера пикселя. Используя 405-нанометровый лазер и воздушную цель 20X, вручную визуализирует ядра, чтобы найти поле вилли, в которых нет заметного движения или дрейфа, избегая областей артефактного движения из-за дыхания, перистализа или сердцебиения. Используя X-Y Scan, заместите X-Y координацию области интересов и переключитесь на цель погружения глицерола 63X.
Приобрети живое изображение на 405-нанометровом канале на срок до 1 минуты, чтобы подтвердить, что вилли в выбранном поле стабилен, при этом регулируя фокус, чтобы найти ортогональный самолет прямо под кончиком виллуса. Затем приобрети z-стеки, начиная с чуть ниже эпителия кончика villus, около 15-20 микрометров до виллуса, пока не будет трудно решить ядра, используя 1,5 микрометровых ступеней. Через 3-5 минут после начала приобретения подтвердите стабильность изображения и гамма-дельта Intraepithelial Cell Motility, и продолжайте приобретать изображения в течение 30-60 минут для каждого поля вилли.
Гамма-дельта Интраэпителиальные лимфоциты демонстрируют динамическое поведение наблюдения, в котором они патрулируют эпителий, мигрируя вдоль мембраны подвала и в боковое межклеточное пространство в состоянии исследования. На этих репрезентативных снимках цветные следы указывают на миграционные пути отдельных гамма-дельта интраепителиальных лимфоцитов в течение 30 минут. Хотя частота внутрипительных лимфоцитов в боковом межклеточном пространстве была увеличена у мышей, обработанных анти-интерлеукин-2 рецепторов бета-антитела, более 30% из них Гамма-дельта Intraepithelial лимфоцитов выставлены холостого поведения.
Этот холостый фенотип был подтвержден значительным снижением как мгновенной скорости, так и коэффициента содержания гамма-дельта интраепителиальных лимфоцитов, после интерлекин-2-рецепторной блокады, по отношению к контролю. Кроме того, простаивающие Гамма-дельта Интраепителиальные лимфоциты имели более длительное время обитали, и чаще локализированы в боковом межклеточном пространстве, по сравнению с подвижными гамма-дельта-интрапителевыми лимфоцитами. Это может быть трудно определить поля вилли, которые не имеют чрезмерного движения из-за перистализа.
Перепозиционирование мыши может помочь в поиске более стабильного поля. Дальнейший анализ данных отслеживания клеток может помочь определить конкретное поведение подвижности, или предоставить дополнительные метрики для измерения клеточных взаимодействий. Интравитальная визуализация и анализ подвижности IEL стали стандартным считывания функции IEL, обеспечивая понимание того, как врожденная иммунная сигнализация регулирует гамма-дельта IEL-функции.
