A microscopia intravital da pequena mucosa intestinal pode fornecer uma visão da dinâmica espesso das interações celulares dentro do epitélio entre diferentes tipos de células imunes, ou entre esses dois compartimentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a aquisição de imagens de alta velocidade e alta resolução dentro da mucosa intestinal em tempo real. Imagens ao vivo do intestino podem fornecer informações adicionais sobre as interações celulares, ou sinalização celular envolvida na imunidade mucosa, biologia epitelial ou biologia do câncer.
Trata-se de um método desafiador que requer a prática da técnica cirúrgica, bem como paciência e posicionamento ideal do mouse para aquisição de imagem. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato transgênico anestesiado, expressando uma proteína fluorescente verde aprimorada, ou EGFP, receptor de células T Gamma-delta, use uma seringa tuberculina para injetar lentamente 200 microliters de Hoechst 33342 Dye Solution recém-preparada no seio venoso retro-orbital. De um a dois minutos após a injeção, aplique pomada nos olhos do animal para evitar que eles sequem.
Em seguida, faça uma incisão vertical de 2CM através da pele e do peritônio, ao longo da linha média do abdômen inferior e use fórceps angulares para retirar cuidadosamente o caecum da cavidade peritoneal. Identifique uma área de 2-3CM do intestino delgado que contenha conteúdo fecal mínimo, tomando cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesenéricos, e devolva cuidadosamente o caecum e o intestino delgado restante para a cavidade peritoneal, deixando o segmento de interesse externalizado. Colocando dois pares de fórceps em ambos os lados do mesentery sublinhado entre os vasos sanguíneos, esfregue suavemente as pontas dos fórceps juntos para criar um buraco na membrana.
Usando fórceps angulares e uma agulha de ponto de fita curva presa a uma sutura de 5CM, penetre um lado do peritônio através do orifício na membrana, e até o outro lado do revestimento peritônio, colocando uma sutura na parte superior, e outra perto do fundo da incisão para fechar a incisão, mantendo o laço do intestino externalizado. Para aumentar a probabilidade de sucesso, não amarre ou rasgue nenhum vaso sanguíneo ao colocar a sutura abdominal e limite qualquer manuseio ím loc. Em seguida, feche a pele sob a alça intestinal da mesma forma, colocando uma sutura no meio da incisão entre as suturas anteriores no peritônio sublinhado.
Usando um eletrocauteno, faça uma linha de perfuração ao longo da fronteira antimesenteric e aplique imediatamente algumas gotas de água na superfície do intestino para evitar danos adicionais nos tecidos induzidos pelo calor. Borrida com um kimwipe para remover água residual. Use uma tesoura de vanna para cortar uma fenda horizontal de aproximadamente 1,5CM na borda distal do tecido cauterizado, ao longo do comprimento da linha cauterizada, em direção à extremidade proximal do segmento tecidual externalizado.
Quando a superfície mucosa estiver exposta, cubra o abdômen com um kimwipe úmido para manter o tecido hidratado. Para a Imagem de Microscopia Confocal do Disco Giratório, transporte o mouse para o microscópio em um vaso coberto. Inicie o software de imagem e incline a cabeça do microscópio para trás, e adicione 150 microlitros de 1 maçaria de pulgas de micromolar Alexa Fluor e a solução salina tampão da Hank no fundo escorregado da tampa de vidro.
Posicione o mouse para que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a mancha de cobertura. Coloque o mouse e o prato sobre o palco de imagem em uma incubadora pré-aquecida. Defina a intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser em não mais de 10-15 miliwatts e 120-150 milissegundos, respectivamente, e ajuste a Média do Quadro para 2.
Ligue a função Ganho de Multiplicação eletrônica para reduzir o ruído de fundo e selecione a Calibração Objetiva 63X para garantir uma medição correta do tamanho do pixel. Utilizando o laser de 405 nanômetros e o objetivo do ar 20X, visualize manualmente os núcleos para localizar um campo de villi que carece de movimento ou deriva perceptível, evitando áreas de movimento artefatoual devido à respiração, peristalse ou batimentos cardíacos. Usando o X-Y Scan, registe a coordenada X-Y do campo de interesse e mude para o objetivo de imersão 63X de glicerol.
Adquira uma imagem ao vivo no canal de 405 nanômetros por até 1 minuto para confirmar que os villi no campo selecionado são estáveis, enquanto ajustam o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villus. Em seguida, adquira pilhas z, partindo logo abaixo do epitélio da ponta villus, cerca de 15-20 micrômetros até o villus até que seja difícil resolver os núcleos, usando 1,5 passos de micrômetro. 3-5 minutos após o início da aquisição, confirme a estabilidade da imagem e a Motilidade celular intraepithelial Gamma-delta, e continue adquirindo imagens por 30-60 minutos para cada campo de villi.
Os linfócitos intraepitheliais gama-delta exibem um comportamento dinâmico de vigilância, no qual patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e para o espaço intercelular lateral em estado de estudo. Nestas imagens representativas, as faixas coloridas indicam os caminhos migratórios de linfócitos intraepitheliais gamma-delta ao longo de 30 minutos. Embora a frequência de linfócitos intraepitheliais no espaço intercelular lateral tenha aumentado em camundongos tratados com anticorpo beta receptor anti-interleucina-2, mais de 30% desses linfócitos intraepitelíacos gama-delta apresentaram um comportamento ocioso.
Este fenótipo de marcha ociosa foi confirmado por uma redução significativa tanto na velocidade instantânea quanto na razão de confinamento dos linfócitos intraepitheliais gama-delta, após o bloqueio interleucina-2-receptor, em relação aos controles. Além disso, os linfócitos intraepitheliais gama-delta ociosos tinham tempos mais longos, e eram mais frequentemente localizados dentro do espaço intercelular lateral, em comparação com linfócitos intraepitheliais glifoseíacos motile Gamma-delta. Pode ser difícil identificar campos de villi que não possuem movimento excessivo devido à peristalse.
O reposicionamento do mouse pode ajudar na localização de um campo mais estável. Uma análise mais aprofundada dos dados de rastreamento celular pode ajudar a identificar comportamentos específicos de motilidade ou fornecer métricas adicionais para medir as interações celulares. A imagem intravital e a análise da iel-motilidade tornaram-se uma leitura padrão da função IEL, fornecendo insights sobre como a sinalização imunológica inata regula a função IEL Gamma-delta.
