La microscopía intravital de la pequeña mucosa intestinal puede proporcionar información sobre la dinámica espaciotemporal de las interacciones celulares dentro del epitelio entre diferentes tipos de células inmunitarias, o entre estos dos compartimentos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la adquisición de imágenes de alta velocidad y alta resolución dentro de la mucosa intestinal en tiempo real. Las imágenes en vivo del intestino pueden proporcionar información adicional sobre las interacciones celulares, o la señalización celular implicada en la inmunidad a la mucosa, la biología epitelial o la biología del cáncer.
Este es un método desafiante que requiere la práctica de la técnica quirúrgica, así como la paciencia y el posicionamiento óptimo del ratón para la adquisición de imágenes. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón transgénico anestesiado, expresando una proteína fluorescente verde mejorada, o receptor de células T de EGFP, Gamma-delta, utilice una jeringa de tuberculina para inyectar lentamente 200 microlitros de solución de tinte Hoechst 33342 recién preparada en el seno venoso retro-orbital. De uno a dos minutos después de la inyección, aplicar un ung en los ojos del animal para evitar que se sequen.
Luego, haz una incisión vertical de 2CM a través de la piel y el peritoneo, a lo largo de la línea media de la parte inferior del abdomen y usa fórceps en ángulo para sacar cuidadosamente el cecum de la cavidad peritoneal. Identificar un área de 2-3CM del intestino delgado que contiene un contenido mínimo de heces, teniendo cuidado de no romper los vasos sanguíneos mesentéricos, y devolver cuidadosamente el cecum y el intestino delgado restante a la cavidad peritoneal, dejando el segmento de interés externalizado. Colocando dos pares de fórceps a cada lado del mesentería subrayado entre los vasos sanguíneos, frote suavemente las puntas de los fórceps para crear un agujero en la membrana.
Usando fórceps angulares y una aguja curva de punta cónica unida a una sutura de 5CM, penetra un lado del peritoneo a través del agujero en la membrana, y hasta el otro lado del revestimiento peritoneal, colocando una sutura en la parte superior, y otra cerca de la parte inferior de la incisión para cerrar la incisión, manteniendo el bucle del intestino externalizado. Para aumentar la probabilidad de éxito, no ate ni rasgue los vasos sanguíneos mientras coloca la sutura abdominal y limite cualquier manejo extraño del intestino. Luego, cierra la piel debajo del lazo intestinal de la misma manera, colocando una sutura en el medio de la incisión entre las suturas anteriores en el peritoneo subrayado.
Usando una electrocauterización, haz una línea de perforación a lo largo del borde antimesentérico y aplica inmediatamente unas gotas de agua a la superficie del intestino para evitar daños adicionales en los tejidos inducidos por calor. Blot con un kimwipe para eliminar el agua residual. Utilice tijeras de vanna para cortar una abertura horizontal de aproximadamente 1,5 CM en el borde distal del tejido cauterizado, a lo largo de la longitud de la línea cauterizada, hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado.
Cuando la superficie de la mucosa esté expuesta, cubra el abdomen con un kimwipe húmedo para mantener el tejido hidratado. Para imágenes de microscopía confocal de disco giratorio, transporte el ratón al microscopio en un recipiente cubierto. Inicie el software de imágenes e incline la cabeza del microscopio hacia atrás, y agregue 150 microlitros de 1 pultorio micromolar Alexa Fluor dye y Hank's Buffered Saline Solution en el fondo deslizado de la cubierta de vidrio.
Coloque el ratón de modo que la superficie mucosa abierta entre directamente en contacto con el cubreobjetos. Coloque el ratón y el plato en la etapa de imágenes en una incubadora precalentó. Establezca la Intensidad de Excitación y el Tiempo de Exposición para cada láser en no más de 10-15 milivatios y 120-150 milisegundos, respectivamente, y ajuste el Promedio de Fotograma a 2.
Active la función Ganancia de multiplicación de electrones para reducir el ruido de fondo y seleccione la calibración de objetivos 63X para garantizar una medición correcta del tamaño de píxel. Usando el láser de 405 nanómetros y el objetivo de aire 20X, visualice manualmente los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento o deriva notables, evitando áreas de movimiento artifactual debido a la respiración, peristalsis o latidos del corazón. Usando el X-Y Scan, registre la coordenada X-Y del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión de glicerol 63X.
Adquiera una imagen en vivo en el canal de 405 nanómetros durante un máximo de 1 minuto para confirmar que las vellosidades en el campo seleccionado son estables, mientras que ajusta el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta del villus. A continuación, adquiera pilas z, comenzando desde justo debajo del epitelio de punta de villus, alrededor de 15-20 micrómetros hasta el villus hasta que sea difícil resolver los núcleos, utilizando pasos de 1,5 micrómetros. 3-5 minutos después de comenzar la adquisición, confirme la estabilidad de la imagen y la motilidad celular intraepitelial gamma-delta, y continúe adquiriendo imágenes durante 30-60 minutos para cada campo de vellosidades.
Los linfocitos intraepiteliales gamma-delta exhiben un comportamiento de vigilancia dinámico, en el que patrullan el epitelio migrando a lo largo de la membrana del sótano y hacia el espacio intercelular lateral en estado de estudio. En estas imágenes representativas, las pistas de color indican las trayectorias migratorias de los linfocitos intraepiteliales gamma-delta individuales en el transcurso de 30 minutos. Aunque la frecuencia de los linfocitos intraepiteliales en el espacio intercelular lateral se incrementó en ratones tratados con anticuerpos beta receptores anti-interleucina-2, más del 30% de estos linfocitos intraepiteliales gamma-delta mostraron un comportamiento inmódico.
Este fenotipo en ralentí fue confirmado por una reducción significativa tanto en la velocidad instantánea como en la relación de confinamiento de los linfocitos intraepiteliales Gamma-delta, tras el bloqueo del receptor de interleucina-2, en relación con los controles. Además, los linfocitos intraepiteliales gamma-delta inactivos tenían tiempos de permanencia más largos, y se localizaban con mayor frecuencia dentro del espacio intercelular lateral, en comparación con los linfocitos intraepiteliales gamma-delta móviles. Puede ser difícil identificar campos de vellosidades que carecen de movimiento excesivo debido a la peristalsis.
Cambiar la posición del ratón puede ayudar a localizar un campo más estable. Un análisis adicional de los datos de seguimiento celular puede ayudar a identificar el comportamiento específico de la motilidad, o a proporcionar métricas adicionales para medir las interacciones celulares. La imagen intravital y el análisis de la motilidad IEL se han convertido en una lectura estándar de la función IEL, lo que proporciona información sobre cómo la señalización innata inmune regula la función gamma-delta IEL.
