קרציות הן אקטופארסיטים המטופדים, מיקרופלוס רייפיצפלוס, הידוע בכינויו קרציית הבקר יש השפעה כלכלית שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. בנוסף, החששות הגוברים לגבי תנאים סביבתיים מושפלים ודאגות לבריאות הציבור הנגרמות על ידי שימוש לא הולם בתרופות כימיות והתנגדות גוברת של אוכלוסיות קרציות לטפילים מסורתיים, מעוררים מחקר על שיטות בקרה חלופיות, כגון שימוש בפטריות entomopathogenic. אלה entomopathogens באופן פעיל להדביק מארחים פרוקי רגליים, דרך קוטיקל שלהם ליישב את גופם.
פרוקי הרגליים עשויים להיות תגובות שונות לזיהום פטרייתי. מערכת החיסון של פרוקי הרגליים מחולקת לתגובות הומוריסטיות ותאיות. התגובה ההומוריסטית כרוכה בתהליך ההמגגלוטינציה וייצור מולקולות מיקרוביאליות, בעוד שהמוציטים מתווים את התגובה החיסונית התאית.
רוב המחקרים על התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מדווחים באמצעות חרקים בעוד התגובות קרציות להישאר פחות נחקר. כמו כן, חיסון פתוגן ואוסף המולימפה קרציות הן טכניקות נפוצות מאוד הדרושות כדי להבין טוב יותר את התגובה החיסונית של פרוקי הרגליים. בהתאם לכך, טכניקות כתובת וידאו זה \משמש לצלם את החיסון, אוסף hemolymph ועיבוד.
מאז hemocytes קרציות קצירת פנים כמה מגבלות, כגון שיבוש תאים, קבלת ערך hemolymph נמוך, ריכוז נמוך של תאים התאושש. מדביק ישירות בתצורה וניתוח של תאים. לאחר איסוף קרציות, לשטוף נקבות שקועות.
השתמש במי ברז לטבול אותם 0.5% פתרון hypochlorite נתרן במשך שלוש דקות נמען זכוכית 500 מיליליטר. להיגיינת קוטיקל, מחלקים נקבות בקבוצות הומוגניות עם 20 נקבות כל אחת. בוצעו שלושה שכפולים של כל קבוצה.
Metarhizium robertsii blastospores שימשו בתהליך החיסון. הוסף נוזל של חמישה microliters metarhizium blastospores השעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק. כדי להאיץ את תהליך החיסון, ניתן להוסיף בועות מרובות למשטח סרט הפרפין מפלסטיק, כל בועה המתאימה לחמישה מיקרוליטרים.
השתמש מזרק אינסולין דק במיוחד מילימטר אחד מחט 0.3 מילימטרים לשים השעיה לחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מהמזרק לפני השימוש בו. לחסן 5 microliters של השעיית פטרייה לתוך נקבת קרצייה בין scutum ו capitulum.
נפח קטן של המולימפה עשוי להיות נוכח על המסגור לאחר חתך המחט. היזהר לא לחסן אוויר. לחסן נקבות עם השעיית פטרייה בין ירך הרגל לבין הגוף של הנקבה באמצעות מזרק אינסולין אחד מיליליטר דק במיוחד יחד עם מחט 0.3 מילימטר.
כאשר חיסון metarhizium blastospores מבוצע בין ירך הרגל לבין הגוף של נקבת הקרצייה, נפח קטן של המולימפה יכול להיות נוכח על הירך לאחר החדרת המחט. היזהר לא לחסן אוויר. השתמש בחלק הגומי של עירוי מכונף להגדיר צינור נימי 0.3 miliimeters וק Tip מסנן כדי לבצע את אוסף המולימפה.
לשבש את קוטיקל הגב הנשי באמצעות מחט 0.3 מילימטרים. לאחר ההפרעה להפעיל לחץ עדין על החלק לפני הלידה של גוף הקרצייה. שימו לב לנוזל כמעט שקוף המתאגרף מאתר ההפרעה.
לאסוף את המולימפה על ידי מציצת הנוזל דרך קצה המסנן יחד לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף צינור נימי 0.3 מילימטרים. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי במהלך חוסר התנועה שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות. המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום.
תשתק את הקרצייה. חותכים חתיכה של רגל קדמית. רגל אחת או יותר ניתן לחתוך, כמו גם את אותה רגל ניתן לחתוך יותר מפעם אחת.
יש להפעיל לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה מופיעה בצד החתך ואספו אותה עם צינור נימי. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי, במהלך הגיוס שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות.
המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום. לאחר איסוף המולימפה, להפקיד אותו 1.5 mililiters microtube מלא בעבר עם 30 קוקטייל פרוטאז microlitres ו 82 microlitres מלוחים חיץ. שמור את המיקרו-צינורות על הקרח לאורך כל אוסף ההמולימפות.
דגימות צנטריפוגה ואת גלולה רכה של hemocytes ייווצר לאחר צנטריפוגה המולימפה. לכימות המולימפה, לכמת את נפח המולימפה שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך microtube והנמכת נפח קוקטייל פרוטאז חיץ מלוחים. הסר בזהירות את ההמולימפום נטול התאים העל-טבעי, והשהה בעדינות את התאים.
לכמת את hemocytes על ידי הצבת 10 microlitres של hemocytes מושעה מחדש בתא Neubauer. עבור תאים השעיה מחדש נעשה שימוש במדיה תרבותית. חותכים את הרגל הקדמית של הקרצייה, מפעילים לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה, מתבוננים בבועה נוזלית שקופה מופיעה באתר החתך.
החל את טיפות ההמולימפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי. לאחר מכן להשתמש בשיטות המתאימות כדי להכתים את התאים. חיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי הקרצייה יכול גם לגרום נזק לאיברים פנימיים של קרציות כגון מידגוט ופקעות מאלפיג'יות.
כאשר מידגוט קרצייה מופרע על ידי המחט באוסף hemolymph הגב הנוזל המתקבל הוא אדום, לא שקוף. הדבר מצביע על אוסף המולימפה שגוי. במקרה זה, המולימפה תיזרק כפי שהוא מזוהם.
זיהום hemolymph ניתן לראות גם כאשר הקרצייה נגועה באופן טבעי עם המון גבוה של פתוגנים, או בשלבים הסופיים לאחר תהליך המוות שנגרם על ידי פתוגנים מחוסנים. נפח ההמולימפות המתקבל לאחר איסוף הגב גבוה יותר מהנפח המתקבל באוסף דרך הרגל. למרות ההיכרות של זיהום הוא גבוה יותר בשיטת האיסוף הראשונה.
גם ריכוז ההמוציטים היה גבוה משמעותית באוסף הגב. כאשר אוסף hemocytes הנכון מבוצע מריחה טובה ניתן להשיג וניתן להבחין hemocytes שונים לאחר הכתם. וידאו זה סיפק מידע על שיטות לבצע חיסון של פתוגן, במיוחד פטריות entomopathogenic, לתוך קרציות ולאסוף המולימפה שלהם.
הטכניקות המוצגות כאן דורשות משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד בצעדים הקלאסיים שלנו למחקרים על פיזיולוגיה של קרציות, פתולוגיה של קרציות ותגובה חיסונית של טיק. הקציר הנכון של תאי פרוקי הרגליים, והמולימפה נטולת תאים חיוניים כדי להרשות לעצמם מידע אמין למחקרים הבאים. מסיבה זו, חשוב גם להיות מודעים לטעויות הנפוצות ביותר שנצפו בביצוע טכניקות אלה.
בנוסף, ההצעות של מחקר זה יקבעו את האתר המתאים יותר לאיסוף המולימפה באמצעות עיוות או חיתוך הרגליים, בהתחשב בהבדל בנפח המתקבל ובהסתברות לזיהום.
