פרוטוקול זה מאפשר לנו להשתמש במספר מופחת של קרציות מה שמפחית את עלות תחזוקת המושבה ומקטין את מספר בעלי החוליות הדרושים להאכלת קרציות. פרוטוקול זה דורש כ-20 קרציות. עם זאת, היתרון העיקרי מלבד שימוש בגודל מדגם קטן הוא שניתן ליישם פרוטוקול זה על מיני קרציות מרובים ושלבי חיים שונים.
מלבד נתיחות קרציות או יישום לקראת אינטראקציות פונדקאי-טפיל, השפעת זיהום פתוגן על הפרשת מיקרו-רנ"א והשפעת שינויים פיזיולוגיים על מיקרו-רנ"א המופרש על ידי קרציות. כדי להתחיל, הכינו מדיה נטולת שלפוחית על ידי הוספת סרום בקר עוברי, ציר טריפטוז פוספט, תרכיז כולסטרול ליפופרוטאין 10%, 5% סודיום ביקרבונט, HEPES ומדיום L15C300 לבקבוק צנטריפוגה פוליקרבונט 26.3 מיליליטר והתאימו את הנפח לפי הצורך. עכשיו ultracentrifuge המדיום ב 100, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.
הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והעבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה טרי. Ultracentrifuge את הצינור שוב. קחו את הסופר-נטנט והעבירו אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר מזהמים.
מכניסים את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר ומאחסנים אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיידרש או עד שלוש שנים. הוסיפו כמות מתאימה של אנטיביוטיקה ל-500 מיקרוליטרים של המדיום נטול השלפוחית בכל באר של צלחת תרבית בת 24 בארות. כעת, הוסיפו PBS עם ריפאמפיצין לבארות שאינן מכילות מדיום נטול שלפוחית כדי למנוע צמיחת חיידקים.
הניחו את הקרציות על מגלשת זכוכית עם סרט שטיח דו-צדדי תחת מיקרוסקופ מנתח. לפני הנתיחה, להוסיף PBS המכיל rifampicin לקרצייה באמצעות מספריים של ארבעה מילימטר Vannas, לעשות חתך של כמילימטר אחד בצד של כל נקבה. כעת, הסירו את הצד הגבי ובלוטות הרוק של הקרצייה, ולאחר מכן הכניסו 20 עד 40 בלוטות רוק של קרציות ב-500 מיקרוליטרים של מדיום ללא שלפוחית שנוספו לבאר אחת בצלחת שטופלה בתרבית רקמה בת 24 בארות.
לדגום את דגימות בלוטת הרוק ב 32 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי לאפשר הפרשת שלפוחית חוץ תאית. בסוף הדגירה, פיפטה את כל המדיום המכיל את בלוטות הרוק לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר צנטריפוגה צנטריפוגה ב 300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. העבר את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.
יש להשעות את הכדור המכיל את בלוטות הרוק ב-RNA מאוחר יותר ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש או ללא הגבלת זמן. כעת, הסר את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה של הסופרנטנט ב -2, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והפיפטציה של הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר גופים אפופטוטיים ושלפוחיות חוץ תאיות גדולות יותר ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן להרכיב מסנן מזרק ניילון מיקרומטר אחד על מזרק 10 מיליליטר ולשמור אותו על צינור ultracentrifuge. לאחר מכן מוסיפים את המדגם וממלאים את המזרק עם 10 מיליליטר של PBS. מעבירים את הסופר-נטנט דרך המסנן לתוך הצינור.
לאחר סינון ואיזון הצינורות, הנח אותם ברוטור 70 Ti ו ultracentrifuge את הצינורות ב 100, 000 פעמים G במשך 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הבועיות החוץ-תאיות המרוכזות יוצרות גלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור והשעה את הכדור ב- PBS.
Pipette 500 microliters של שלפוחית חוץ תאית לתוך מסנן צנטריפוגלי 300 K צנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת הסביבה ולחזור על הליך זה עד כל שלפוחית חוץ תאית מסוננים. לבסוף, הוסף 400 microliters של PBS מעוקר לעמודה ומערבבים היטב כדי להסיר שלפוחית חוץ תאית המחוברת לממברנה. לאחר מכן הכניסו את הדגימה לצינור חופשי של 1.5 מיליליטר DNAase RNAse.
הריכוז והגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות השתנו בהתאם למין ולשלב החיים של הקרציות בין ההעתקים הביולוגיים של נקבות, זכרים ונימפות. עבור כל השכפולים הביולוגיים המשולבים, נצפו תוצאות דומות. ניתוח של רנ"א קטנים שבודדו מבלוטת הרוק הראה פסים המתאימים לרנ"א ריבוזומלי ומיקרו-רנ"א.
עם זאת, הרנ"א הריבוזומלי נעדר בבועיות שבודדו מבלוטות הרוק, ודגימות מיקרו-רנ"א שטוהרו מבועיות חוץ-תאיות הראו ירידה רבה יותר. לאחר ההעשרה, דגימות המיקרו-רנ"א שטוהרו מכלי רכב חשמליים הראו השפלה מינימלית וריכוז מיקרו-רנ"א מספיק לסינתזה של ספריית cDNA. גודל הפס הצפוי של כ-150 זוגות בסיסים לאחר קבלת הכנת ספריית cDNA מסמל ספריות RNA cDNA קטנות.
במהלך הכנה ללא שלפוחית, הקפד לבצע את השלבים כדי למנוע זיהום שלפוחית חיצונית. במהלך הכנת צלחת היטב, הקפידו להוסיף אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום חיידקי מהמיקרוביום של הקרציות. המיקרו-רנ"א שחולצו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש ליצירת פרופילים ולניסויים פונקציונליים כדי לאמת תפקידי מיקרו-רנ"א כגון חיזוי מטרות של מסלולי מיקרו-רנ"א, ניסויי עיכוב וחיקוי.
