Bu protokol, hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tarladaki diksiyonun ilk görünümünden merkezi bir aktivite düzeyinde moleküler konformasyona kadar kullanılabilir. Hızlı immünokromtografik tanı testi, kuduz tanısı için referans materyallerin bulunmadığı Afrika ve Asya'daki kırsal ve kırsal özellikler için yararlı bir alternatiftir. Prosedürü gösteren simon Bonas benim laboratuvarımdan bir teknisyen olacak.
Prosedürün ilk bölümünü gösteren İbrahima Dicko, Bamako Laboratoire Merkez Veteriner bir teknik olacak, Mali. Foramen magnum erişmek için, ilk servikal vertebra önce hayvan kafası kaldırmak için bir bıçak kullanın. Ve bir beyin sapı örneği toplamak için uygun bir araç kullanın.
Tek kullanımlık pipet, saman içme, kelepçe veya damlalık gibi burada gösterildiği gibi. Beyin sapı daha sonra açıkça burada bu pipet ucu ile gösterildiği gibi görülebilir. Bu beyin sapı bir içme saman gibi bir kısmını toplamak için uygun bir araç kullanın.
Dikkatlice yerleştirin ve beyin dokusunu toplamak için yavaşça açın. Biyopsiyi toplamak için pipeti çıkarmadan önce parmağınızla takmayı unutmayın. Bir kelepçe kullanımı da mümkündür.
Foramen magnum düzeyinde beyin sapı daha büyük parçaları toplamak için. Alternatif olarak, beyin sapını toplamak için kitisağlanan damlalık doğrudan kullanmak mümkündür. İçme saman benzer şekilde, dikkatlice bastırırken damlalık takın ve beyin dokusunu toplamak için yavaşça açın.
Sonra beyin dokusu aspire ve bir tüp stoper gibi bir kap içine yerleştirin. Doğru bir tanı için örnek toplama sırasında medulla ablongata içeren beyin sapı toplamak için önemlidir. Homojen bir süspansiyon elde edilene kadar, tamponu içeren beyin malzemesini bez veya damlalıkla yaklaşık 30 saniye boyunca doğrudan tüpte dikkatlice ezin.
Damlalık kullanarak, test cihazındaki numune girişine süspansiyonun yaklaşık 100 mikrolitresini dört damla yatırın. Yüksek viskozite süspansiyonu nedeniyle gecikme veya göçün başlamasını hızlandırma durumunda, damlalıklı cihazın depozito alanının alt kısmını hafifçe kazıyın. Test aygıtını okumadan bir ila beş dakika önce tam örnek geçişi bekleyin.
İki satır görünür olduğunda kuduz için pozitif olarak kabul edilir. Negatif, yalnızca kontrol satırı varsa. Yalnızca test satırı veya hiçbir satır görünürse geçersizdir.
RNA'yı bir aygıt örneğinden çıkarmak için cihazı dikkatlice açın ve filtre kağıdını çıkarın. Numunenin depozito alanını toplayın ve numuneyi bir mililitre trireaktif LS'e yerleştirin. Düzenli nazik manuel ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat sonra, standart RNA ekstraksiyon protokollerine göre supernatant tüplerden RNA ayıklayın. Üreticilerin tavsiyelerine göre RNA çökeci kolaylaştırmak için glikojen iki mikrolitre ekleme.
RNA resuspension'ın son hacmini nükleaz içermeyen suyla 50 mikrolitreye ayarlayın. Ve tabloya göre üç farklı ters transkriptaz kantitatif PCR tahlilleri için ana karışım reaksiyon çözeltisi çözümünü hazırlayın. Tabloda belirtildiği gibi astar ve probları kullanma.
Seyreltilmiş RNA örneklerinin beş mikrolitresi. Ve uygun 96 iyi reaksiyon plakaları çoğaltılır üç farklı tahlillerin her biri için ana karışımı 15 mikrolitre. Yinelenen her plakaya her bir titreşme için uygun pozitif ve negatif denetimleri ekleyin.
Daha sonra tabloda belirtildiği gibi termal bisiklet koşullarını takip eden farklı tahlilleri çalıştırın. Sonuçlar tabloda belirtildiği gibi analiz edilebilir. Bir beyin biyopsisi toplama yüksek kaliteli örneklerin toplama garanti etmek mümkün olduğunca basittir.
Referans tekniği ile karşılaştırıldığında hızlı immünokromatografik tanı testinin duyarlılığı ve özgüllüğü bu protokolleri kullanan tüm laboratuvarlarda yüksekti. Test edilen örneklerin kümülatif sayısına göre genel duyarlılık ve özgüllük %95'in üzerindeydi Hızlı immünokromatografik tanı testi enfekte hayvanların beyin biyopsilerinde lisavirüs saptanması için uygundur. Lisavirus antijenlerinin düzeyi kuduz tanısı için önemli olduğundan, titre virüs süspansiyonları test ederken algılama sınırı yüksek kalır.
Bu temsili sonuçlarda, lisavirüs viral polimerazın çift kombine panlisavirüs ters transkripsiyonu ile RNA tespiti nden sonra elde edilen 51 pozitif hızlı immünokromtografik tanı testi nden oluşan bir panel uygulandı. Buna ek olarak, kısmi nükleoprotein geninin hemi iç içe PCR hedeflemesi kullanılarak 14 örnek için genotipleme yapılabilir. Tanılama ve RT PCR sonra dayalı genotipleme için test şeridi için ayıklama, ya da ek uzun dize analizi için.
Hızlı immünokromtografik tanı testi hızlı ve doğru kuduz tanısı sağlayabilir. Bu da sürekli dalga tabanlı gözetleme ve kontrol sistemlerinde dalga işlevini korumak için çok önemlidir. Ve humannnes en aza indirmek.
