Questo protocollo può essere utilizzato per la diagnosi postmortem della rabbia animale dalla visione iniziale della dizione sul campo alla conformazione molecolare in un livello centralizzato di attività. I test di diagnosi immunocromatografica rapida sono un'alternativa utile per i tratti rurali e rurali in Africa e in Asia in cui non sono disponibili materiali di riferimento per la diagnosi della rabbia. A dimostrare la procedura sarà Simon Bonas un tecnico del mio laboratorio.
A dimostrare la prima parte della procedura sarà Ibrahima Dicko, tecnico del Laboratoire Central Veterinaire di Bamako, maliano. Per accedere al forame magnum, utilizzare un coltello per rimuovere la testa dell'animale prima delle prime vertebre cervicali. E usare uno strumento appropriato per raccogliere un campione di staminali cerebrali.
Come una pipetta usa e getta, paglia da bere, morsetto o contagocce come mostrato qui. Lo stelo cerebrale è quindi chiaramente visibile come dimostrato qui con la punta di questa pipetta. Utilizzare uno strumento appropriato per raccogliere una parte di questo tronco encefalico come una cannuccia da bere.
Inseriscilo con cura e gira delicatamente per raccogliere il tessuto cerebrale. Non dimenticare di tappare la paglia con il dito prima di rimuoverla, al fine di raccogliere la biopsia. È anche possibile l'uso di un morsetto.
Al fine di raccogliere pezzi più grandi di tronco encefalico a livello del forame magnum. In alternativa, è possibile utilizzare direttamente il contagocce fornito nel kit per raccogliere lo stelo cerebrale. Analogamente alla cannuccia da bere, inserire accuratamente il contagocce mentre si preme e girare delicatamente per raccogliere il tessuto cerebrale.
Quindi aspirare il tessuto cerebrale e posizionare in un contenitore come il tappo di un tubo. Per una diagnosi accurata è fondamentale raccogliere il tronco encefalico che contiene il midollo ablongata, durante la raccolta del campione. Schiacciare con cura il materiale cerebrale direttamente nel tubo contenente il tampone con il tampone o il contagocce per circa 30 secondi fino a ottenere una sospensione omogenea.
Utilizzando il contagocce, depositare quattro gocce circa 100 microlitri della sospensione nell'ingresso del campione sul dispositivo di prova. In caso di ritardo dovuto a sospensioni ad alta viscosità o per accelerare l'inizio della migrazione, graffiare delicatamente il fondo del sito di deposito del dispositivo con il contagocce. Attendere la migrazione completa dell'esempio, da uno a cinque minuti prima di leggere il dispositivo di test.
Un campione è considerato positivo per la rabbia quando sono visibili due linee. Negativo, se è presente solo la riga di controllo. E non valido se sono visibili solo la linea di test o nessuna linea.
Per estrarre l'RNA da un campione di dispositivo, aprire attentamente il dispositivo e rimuovere la carta da filtro. Raccogliere l'area di deposito del campione e posizionare il campione in un millilitro di LS trireagente. Dopo un'ora a temperatura ambiente con agitazione manuale delicata regolare, estrarre l'RNA dal supernatante dei tubi secondo i protocolli di estrazione standard dell'RNA. Aggiunta di due microlitri di glicogeno per facilitare la precipitazione dell'RNA secondo le raccomandazioni dei produttori.
Regolare il volume finale della resopensione dell'RNA a 50 microlitri con acqua priva di nucleasi. E preparare la soluzione di reazione master mix per i tre diversi test quantitativi PCR della transcriptasi inversa secondo la tabella. Utilizzo dei primer e delle sonde come indicato nella tabella.
A cinque microlitri dei campioni diluiti di RNA. E 15 microlitri di master mix a ciascuno dei tre diversi saggi in duplicato nelle 96 placche di reazione del pozzo appropriate. Aggiungere i controlli positivi e negativi appropriati per ogni saggio a ciascuna piastra in duplicato.
Quindi eseguire i diversi saggi seguendo le condizioni di ciclo termico come indicato nella tabella. I risultati possono essere analizzati come indicato nella tabella. La raccolta di una biopsia cerebrale è il più semplice possibile per garantire la raccolta di campioni di alta qualità.
Rispetto alla tecnica di riferimento la sensibilità e la specificità del test diagnostico immunocromatografico rapido era elevata in tutti i laboratori che utilizzano questi protocolli. Sulla base del numero cumulativo di campioni testati, la sensibilità e la specificità complessive erano oltre il 95%Il test diagnostico immunocromatografico rapido è adatto per rilevare il lisavirus nelle biopsie cerebrali da animali infetti. Poiché il livello di antigeni lisavirus è importante per la diagnosi della rabbia, tuttavia, il limite di rilevamento rimane elevato quando si testano sospensioni del virus titole.
In questi risultati rappresentativi, ottenuti dopo il rilevamento dell'RNA mediante doppio panlisavirus combinato reverse transcriptase quantitative PCR targeting della polimerasi virale del lisavirus, è stato eseguito un pannello di 51 test diagnostici immunocromatografici rapidi positivi. Inoltre, la genotipizzazione potrebbe essere eseguita per quattordici dei campioni utilizzando il targeting PCR emi-annidato del gene della nucleoproteina parziale. Diagnostica ed estrazione per la striscia di prova per la genotipizzazione basata su RT PCR o per ulteriori analisi lunghe delle stringhe.
Il test di diagnosi immunocromatografica rapida può fornire una diagnosi di rabbia rapida e accurata. Che è fondamentale per mantenere la funzione d'onda nei sistemi di sorveglianza e controllo basati sulle onde continue. E minimizzare le humannne.
