Este protocolo pode ser usado para o diagnóstico pós-morte da raiva animal desde a visão inicial da dicção no campo até a conformação molecular em um nível centralizado de atividade. O rápido diagnóstico imunocromatográfico é uma alternativa útil para os traços rurais e rurais na África e na Ásia, nos quais não estão disponíveis materiais de referência para o diagnóstico da raiva. Demonstrando o procedimento será Simon Bonas um técnico do meu laboratório.
A primeira parte do procedimento será Ibrahima Dicko, um tecnicion do Laboratoire Central Veterinaire em Bamako, Mali. Para acessar o foramen magnum, use uma faca para remover a cabeça do animal antes das primeiras vértebras cervicais. E use uma ferramenta apropriada para coletar uma amostra de tronco cerebral.
Como uma pipeta descartável, beber palha, grampo ou conta-gotas como mostrado aqui. O tronco cerebral é então claramente visível como demonstrado aqui com a ponta desta pipeta. Use uma ferramenta apropriada para coletar uma parte deste tronco cerebral, como um canudo de beber.
Insira-o cuidadosamente e gire suavemente para coletar o tecido cerebral. Não se esqueça de tapar a palha com o dedo antes de removê-la, a fim de coletar a biópsia. O uso de um grampo também é possível.
A fim de coletar pedaços maiores de tronco cerebral ao nível do foramen magnum. Alternativamente, é possível usar diretamente o caixa de bebê fornecido no kit para coletar o tronco cerebral. Da mesma forma que a palha de beber, insira o entregador cuidadosamente enquanto pressiona e gire suavemente para coletar o tecido cerebral.
Em seguida, aspire o tecido cerebral e colocá-lo em um recipiente como a rolha de um tubo. Para um diagnóstico preciso é fundamental coletar o tronco cerebral que contém a medulla ablongata, durante a coleta da amostra. Esmague cuidadosamente o material cerebral diretamente no tubo contendo o tampão com o cotonete ou conta-gotas por cerca de 30 segundos até que uma suspensão homogênea seja obtida.
Usando o conta-gotas, deposite quatro gotas aproximadamente 100 microliters da suspensão na entrada da amostra no dispositivo de teste. Em caso de atraso devido à suspensão de alta viscosidade ou para acelerar o início da migração, arranhe suavemente a parte inferior do local de depósito do dispositivo com o conta-gotas. Aguarde a migração completa da amostra, de um a cinco minutos antes de ler o dispositivo de teste.
Uma amostra é considerada positiva para raiva quando duas linhas são visíveis. Negativo, se apenas a linha de controle estiver presente. E inválido se apenas a linha de teste ou nenhuma linha estiver visível.
Para extrair o RNA de uma amostra do dispositivo, abra cuidadosamente o dispositivo e remova o papel do filtro. Colete a área de depósito da amostra e coloque a amostra em um mililitro de LS trireagente. Após uma hora em temperatura ambiente com agitação manual suave regular, extraia o RNA dos tubos sobrenantes de acordo com os protocolos padrão de extração de RNA. Adicionando dois microliters de glicogênio para facilitar a precipitação do RNA de acordo com as recomendações dos fabricantes.
Ajuste o volume final da ressuspensão de RNA para 50 microliters com água livre de nuclease. E prepare a solução de reação de mix mestre para os três diferentes ensaios de PCR quantitativo de transcriptase reversa de acordo com a tabela. Usando os primers e sondas conforme indicado na tabela.
Em cinco microliters das amostras diluídas de RNA. E 15 microliters de mistura mestre para cada um dos três ensaios diferentes em duplicata nas placas de reação adequadas 96 poços. Adicione os controles positivos e negativos apropriados para cada ensaio a cada placa em duplicata.
Em seguida, execute os diferentes ensaios seguindo as condições de ciclismo térmico, conforme indicado na tabela. Os resultados podem ser analisados conforme descrito na tabela. A coleta de uma biópsia cerebral é o mais simples possível para garantir a coleta de amostras de alta qualidade.
Em comparação com a técnica de referência, a sensibilidade e especificidade do teste diagnóstico imunocromatográfico rápido foi alta em todos os laboratórios utilizando esses protocolos. Com base no número acumulado de amostras testadas, a sensibilidade e especificidade globais foram superiores a 95% O teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido é adequado para detectar lisavírus em biópsias cerebrais de animais infectados. Como o nível de antígenos lisavírus é importante para o diagnóstico da raiva, no entanto, o limite de detecção permanece alto ao testar suspensões de vírus titulados.
Nestes resultados representativos, obtidos após a detecção do RNA por dupla transcriptavírus reversa de transcriptase de direcionamento quantitativo pcr da polimerase viral do lisavirus, foi realizado um painel de 51 testes diagnósticos rápidos e rápidos positivos. Além disso, a genotipagem poderia ser realizada para quatorze das amostras utilizando o direcionamento de PCR hemi-aninhado do gene de nucleoproteína parcial. Diagnóstico e extração para a tira de teste para genotipagem com base no depois do RT PCR, ou por análise adicional de cadeia longa.
O rápido teste de diagnóstico imunocromatográfico pode fornecer um diagnóstico de raiva rápido e preciso. O que é crucial para manter a função de onda em sistemas contínuos de vigilância e controle baseados em ondas. E minimizando as humanidades.
