Dieses Protokoll kann für die postmortale Diagnose von Tierischen von der ersten Sicht der Diktion im Feld bis zur molekularen Konformation in einer zentralisierten Aktivitätsebene verwendet werden. Schnelle immunchromatographische Diagnosetests sind eine nützliche Alternative für ländliche und ländliche Merkmale in Afrika und Asien, in denen keine Referenzmaterialien für die Tollwutdiagnose verfügbar sind. Demonstriert wird das Verfahren von Simon Bonas, einem Techniker aus meinem Labor.
Demonstrieren den ersten Teil des Verfahrens wird Ibrahima Dicko, ein Techniker von der Laboratoire Central Veterinaire in Bamako, Mali. Um auf das Foramen magnum zuzugreifen, verwenden Sie ein Messer, um den Tierkopf vor den ersten Halswirbeln zu entfernen. Und verwenden Sie ein geeignetes Werkzeug, um eine Hirnstammprobe zu sammeln.
Wie z. B. eine Einwegpipette, Trinkhalm, Klemme oder Tropf, wie hier gezeigt. Der Hirnstamm ist dann deutlich sichtbar, wie hier mit der Spitze dieser Pipette gezeigt wird. Verwenden Sie ein geeignetes Werkzeug, um einen Teil dieses Hirnstamms wie einen Trinkhalm zu sammeln.
Legen Sie es vorsichtig und drehen Sie vorsichtig, um das Gehirngewebe zu sammeln. Vergessen Sie nicht, das Stroh mit dem Finger zu stecken, bevor Sie es entfernen, um die Biopsie zu sammeln. Der Einsatz einer Klemme ist ebenfalls möglich.
Um größere Stücke des Hirnstamms auf der Ebene des Foramen magnum zu sammeln. Alternativ ist es möglich, direkt den im Kit bereitgestellten Trabfall zu verwenden, um den Hirnstamm zu sammeln. Ähnlich wie beim Trinkhalm, legen Sie den Tracht vorsichtig beim Drücken und drehen Sie sanft, um das Gehirngewebe zu sammeln.
Dann das Hirngewebe ansaugen und in einen Behälter wie den Stopfen einer Röhre legen. Für eine genaue Diagnose ist es wichtig, den Hirnstamm, der die Medulla ablongata enthält, während der Probenentnahme zu sammeln. Das Hirnmaterial mit dem Tupfer oder Traber vorsichtig etwa 30 Sekunden lang direkt in der Röhre zerkleinern, bis eine homogene Suspension erhalten ist.
Mit dem Tredase vier Tropfen etwa 100 Mikroliter der Suspension im Probeneinlass auf dem Prüfgerät ablegen. Im Falle einer Verzögerung aufgrund einer hohen Viskositätsaufhängung oder um den Beginn der Migration zu beschleunigen, kratzen Sie vorsichtig den Boden der Ablagerungsstelle des Geräts mit dem Trsetzer. Warten Sie auf die vollständige Beispielmigration, ein bis fünf Minuten, bevor Sie das Testgerät lesen.
Eine Probe wird als positiv für Tollwut betrachtet, wenn zwei Linien sichtbar sind. Negativ, wenn nur die Steuerlinie vorhanden ist. Und ungültig, wenn nur die Testzeile oder keine Linien sichtbar sind.
Um die RNA aus einer Geräteprobe zu extrahieren, öffnen Sie das Gerät vorsichtig und entfernen Sie das Filterpapier. Sammeln Sie den Ablagerungsbereich der Probe und legen Sie die Probe in einen Milliliter Trireagenz LS. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur mit regelmäßiger sanfter manueller Agitation, extrahieren Sie die RNA aus den Röhren, die nach Standard-RNA-Extraktionsprotokollen überstand. Hinzufügen von zwei Mikroliter Glykogen, um die RNA-Ausfällung nach den Empfehlungen der Hersteller zu erleichtern.
Stellen Sie das Endvolumen der RNA-Resuspension auf 50 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser ein. Und bereiten Sie die Master-Mix-Reaktionslösung für die drei verschiedenen Reverse-Transkriptase quantitativePCR-Assays nach der Tabelle. Verwenden der Primer und Sonden, wie in der Tabelle angegeben.
Bei fünf Mikrolitern der verdünnten RNA-Proben. Und 15 Mikroliter Master-Mix zu jedem der drei verschiedenen Assays in Duplikat in den entsprechenden 96 Well-Reaktionsplatten. Fügen Sie die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen für jeden Assay zu jeder Platte in doppelter Ausführung hinzu.
Führen Sie dann die verschiedenen Assays nach den thermischen Radfahrbedingungen aus, wie in der Tabelle angegeben. Die Ergebnisse können wie in der Tabelle beschrieben analysiert werden. Die Entnahme einer Hirnbiopsie ist so einfach wie möglich, um die Sammlung von hochwertigen Proben zu gewährleisten.
Im Vergleich zur Referenztechnik war die Empfindlichkeit und Spezifität des schnellen immunchromatographischen Diagnostischen Tests in allen Laboratorien, die diese Protokolle verwenden, hoch. Basierend auf der kumulativen Anzahl der getesteten Proben lag die Gesamtempfindlichkeit und Spezifität bei über 95%Der schnelle immunchromatographische diagnostische Test ist für den Nachweis von Lisavirus in Hirnbiopsien von infizierten Tieren geeignet. Da der Gehalt an Lisavirus-Antigenen für die Tollwut-Diagnose wichtig ist, bleibt die Nachweisgrenze jedoch hoch, wenn titrierte Virussuspensionen getestet werden.
In diesen repräsentativen Ergebnissen, die nach dem RNA-Nachweis durch duale kombinierte Panlisavirus-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR-Targeting der viralen Polymerase des Lisavirus erhalten wurden, wurde ein Panel von 51 positiven schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests durchgeführt. Darüber hinaus konnte für vierzehn Proben Genotypisierung mit der hemi-geschachtelten PCR-Targeting des partiellen Nukleoprotein-Gens durchgeführt werden. Diagnose und Extraktion für den Teststreifen für die Genotypisierung basierend auf nach RT PCR oder durch zusätzliche lange String-Analyse.
Der schnelle immunchromatographische Diagnosetest kann eine schnelle und genaue Tollwutdiagnose liefern. Was entscheidend für die Aufrechterhaltung der Wellenfunktion in kontinuierlichen wellenbasierten Überwachungs- und Steuerungssystemen ist. Und die Minimierung von Humannnes.
