המחקר של תפקוד גנים ומחלות מעוכבים על ידי הטבע החיצוני של האוכלוסייה האנושית. הרקעים הגנטיים השונים של קווי תאי iPS ספציפיים למטופל ושליטה יכולים להשפיע על יעילות ההידול ועל פנוטיפים שנמצאו בהקשה תפקודית נתונה. השימוש בקווים זהים גנטית או isogenic שבו ההבדל היחיד הוא מוטציה מסוימת של עניין הוא קריטי כדי להתגבר על נושאים אלה.
מחלות אנושיות רבות נגרמות על ידי מוטציות הטרוזיגיות, אשר יכול להיות קשה ליצור עם מערכת CRISPR-Cas9. זאת בשל הדור של מוטציות indel ב allele לא ממוקד שיכול להתרחש בתדירות גבוהה מאוד. הטכניקה שלנו מתגברת על בעיה זו באמצעות שתי תבניות תיקון שרק אחת מהן מטפחת את המוטציה של עניין.
כל חוקר שמנסה טכניקה זו צריך להיות מיומן בתרבות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית. הדגמת וידאו של קטיף המושבה יהיה מועיל להראות גודל נכון מורפולוגיה, כמו גם טכניקה המשמשת לקטוף הקרנה. הוכחת הליך זה יהיה ליאו קרדנס.
כדי להתחיל, צלחת ESCs אנושי על MEFs מוקרן בצלחת 6-well. הכינו את תערובת המאסטר של ההטרמפים. מערבבים על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
כאשר התאים מגיעים 70 עד 80%confluency, ולאחר מכן, מוסיפים את תערובת מאסטר transfection טיפה חכם לכל באר עם תאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לשנות את המדיה כל 24 שעות. כדי לקצור את התאים, הראשון, דגירה התאים עם טריפל E במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר MEFs אנזימטית.
הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום HESC עם 10 מעכבי רוק מיקרומולר. תאי גלולה ב 300 פעמים g במשך שלוש דקות ולהשעות מחדש 0.5 מיליליטר של מדיום ESC אנושי עם 10 מעכבי רוק micromolar. לסנן את ההשעיה התא לתוך צינור חמישה מיליליטר דרך כובע מסננת תא 35 מיקרון.
באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, שער על תאים חיים ומיין את התאים הירוקים פלורסנט חלבון חיובי. לאחר מכן, להעביר מקסימום של 1.5 פעמים 10 לארבעת התאים ממוינים ישירות לתוך צלחת 10 ס"מ מצופה מטריצת קרום מרתף אחד עד שלושה MEFs מוקרן ומדיום ESC אנושי המכיל מעכבי רוק. שינוי בינוני מדי יום באמצעות מדיום ESC האנושי ללא מעכבי ROCK.
לאחר 10 עד 15 ימים, המושבות הן בקוטר של מילימטר עד שני מילימטרים בקירוב. תחת מיקרוסקופ, השתמש פיפטה P200 כדי לגרד בזהירות שיבוט יחיד ולמשוך תאים לתוך פיפטה. מפזרים את התאים באר של צלחת 96 באר על ידי צינור בעדינות שלוש עד ארבע פעמים במדיום נערך עם המושבה.
לאחר מכן, לבחור 20 מושבות עבור כל מדריך RNA ולחלק לתוך צינורות פס PCR להקרנה. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. עכשיו, כדורי תא דגירה ב20 microliters של חיץ Proteinase K לבודד DNA ומערבולת במרץ.
צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, בצע הקרנת PCR של ה-DNA הערוך. הוסיפו לצינורות 20 מיקרוליטרים של תערובת אב, כולל פריימרים קדמיים והפוךים, שנועדו להגביר את אזור העניין, כמו גם חמישה מיקרוליטרים של תקציר Proteinase K.
השתמש ב- DNA גנומי מבודד מהקו iPSC הבקרה כדי לאשר אמפייקון נקי בעת ביצוע PCR ההקרנה. להעריך את שינויי הגודל של מוצרי PCR לאחר שעה אחת של אלקטרופורזה ב 70 עד 90 וולט על 2.5% משקל לפי נפח אגרוז ג'ל. כל הבדל גודל מעיד על מחשוף.
כדי לשנות את הדנ"א של אוליגו הגדיל הבודד ואת פלסמיד CRISPR-Cas9, צלחת קו תא היעד בצלחת 6 באר על MEFs מוקרן להגיע 70 עד 80% confluency לאחר יותר מדי דגירה לילה. הגדר את תגובת ההמרה כמתואר. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה transfection טיפה חכם לתאים. לאחר 48 שעות, הכן את התאים למיון תאים כבעבר. כ-10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לקטוף מושבות בצינורות פס PCR ולתוך באר של צלחת של 12 בארות מצופה מראש בג'לטין ו- MEFs.
להעביר 100 microliters של התאים לכל באר של צלחת 24 או 48 באר, מצופה בעבר עם ג'לטין ו MEFs מוקרן במדיום ESC אנושי עם מעכבי רוק. השתמש ב-100 המיקרוליטרים הנותרים לבידוד דנ"א. כדי לבדוק אינטגרציה מוצלחת של ה-DNA אוליגו גדיל יחיד, לקחת חמישה microliters של DNA מבודד מכל מושבה לבצע PCR באמצעות פריימרים ההקרנה תוכנן בעבר.
לטהר את מוצרי PCR ולהכין את 40 microliters של עיכול אנזים הגבלה באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב- DNA אוליגו גדיל יחיד. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן במשך שעה עד שלוש שעות. לאחר מכן, לדמיין את מוצרי PCR מתעכל הוסיף עם צבע טעינה על 1.5% משקל לפי נפח אתידיום ברומיד אגרוז ג'ל, אלקטרופורזה ב 80 כדי 100 וולט במשך 40 דקות.
אם אינטגרציה מוצלחת של הדנ"א אוליגו גדיל יחיד התרחשה, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות פריימר מקונן. במחקר זה, לבניית RNA מדריך, רצועת זוג בסיס 100 הוצאה מג'ל אגרוז 1.5%. לאחר החיתוך התאי, אימות של חיתוך RNA מדריך היה חזותי באמצעות ג'ל 2.5%agarose.
מוצר PCR של זוג בסיס 180 הראה בקרה לא חתוכות ושכפולים שונים עם משמרות פס המציינות היווצרות indel. למדריך שונה RNAs היו יעילות חיתוך שונה. כדי למנוע חיתוך מחדש של CRISPR-Cas9 של אללים ערוכים, רצף PAM שונה באמצעות מוטציה G ל- A שקטה.
מוטציה שקטה ברצף PAM יצרה אתר הגבלה ייחודי, המסייע לסנן שילוב מוצלח לאלל אחד או שניים. ניתן להשתמש בקווי תאי גזע ערוכים בגנום בהבינות במורד הזרם ובמסיונות תפקודיים כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה נתונה על ההתפתחות האנושית והמחלות. מתודולוגיה זו מאפשרת לדור של קווי תאים איזוגניים עם מוטציות הטרוזיגיות או הומוזיגיות ספציפיות, המעורבות במגוון רחב של מחלות אנושיות.
מודלים אלה של מחלות סוללים את הדרך לפיתוח טיפולים תאיים חדשים, כמו גם מציעים פלטפורמות לגילוי תרופות.
