El estudio de la función genética y la enfermedad se ven obstaculizados por la naturaleza de la raza de la población humana. Los diferentes antecedentes genéticos de las líneas celulares iPS específicas del paciente y del control pueden afectar la eficiencia de la diferenciación y los fenotipos que se encuentran en un ensayo funcional determinado. El uso de líneas genéticamente idénticas o isogénicas donde la única diferencia es la mutación particular de interés es fundamental para superar estos problemas.
Muchas enfermedades humanas son causadas por mutaciones heterocigotas, que pueden ser difíciles de generar con el sistema CRISPR-Cas9. Esto se debe a la generación de mutaciones indel en el alelo no dirigido que pueden ocurrir a muy alta frecuencia. Nuestra técnica supera este problema mediante el uso de dos plantillas de reparación de las cuales sólo uno alberga la mutación de interés.
Cualquier investigador que intente esta técnica debe ser experto en el cultivo de células madre pluripotentes humanas. La demostración en vídeo de la recolección de colonias será útil para mostrar el tamaño y la morfología correctos, así como la técnica utilizada para la recolección y el cribado. Demostrar este procedimiento será Leo Cárdenas.
Para empezar, placa ESCs humanos en MEF irradiados en una placa de 6 pozos. Prepare la mezcla maestra de transfección. Mezclar en pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Cuando las células alcanzan 70 a 80% de confluencia, entonces, agregue la mezcla maestra de transfección gota sabia a cada pozo con las células y la incubación a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cambie los medios cada 24 horas. Para cosechar las células, primero, incubar las células con Triple E durante tres minutos a temperatura ambiente para eliminar los MEF enzimáticamente.
Añadir 0,5 mililitros de medio HESC con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Células de pellets a 300 veces g durante tres minutos y re-suspender en 0,5 mililitros de medio ESC humano con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Filtre la suspensión celular en un tubo de cinco mililitros a través de una tapa de colador celular de 35 micras.
Usando la clasificación celular activada por fluorescencia, atenuse en las células vivas y clasifique las células positivas de proteína fluorescente verde. A continuación, transfiera un máximo de 1,5 veces 10 a las cuatro células ordenadas directamente en un plato de 10 centímetros recubierto con una a tres matrices de membrana de sótano y MEF irradiado y un medio ESC humano que contiene inhibidor de ROCK. Cambie el medio diario utilizando el medio ESC humano sin inhibidor de ROCK.
Después de 10 a 15 días, las colonias tienen aproximadamente de uno a dos milímetros de diámetro. Bajo un microscopio, utilice una pipeta P200 para raspar cuidadosamente un solo clon y dibujar células en la pipeta. Dispersar las células en un pozo de una placa de 96 pozos pipeteando suavemente de tres a cuatro veces en el medio elaborado con la colonia.
A continuación, escoja 20 colonias para cada ARN guía y prescinda en tubos de tira de PCR para su cribado. Pele las células por centrifugación a 10.000 veces G durante cinco minutos. Ahora, incubar gránulos celulares en 20 microlitros de proteinasa K tamponado para aislar el ADN y el vórtice vigorosamente.
Centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos. A continuación, realice la detección de PCR del ADN editado. Añadir en los tubos 20 microlitros de una mezcla maestra, incluyendo imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, diseñadas para amplificar la región de interés, así como cinco microlitros del digesto Proteinase K.
Utilice ADN genómico aislado de la línea iPSC de control para confirmar un amplicon limpio al realizar la PCR de cribado. Evaluar los cambios de tamaño de los productos de PCR después de una hora de electroforesis a 70 a 90 voltios en un 2,5% de peso en gel de agarosa de volumen. Cualquier diferencia de tamaño es indicativa de escote.
Para transfecar el ADN oligo de una sola hebra y los plásmidos CRISPR-Cas9, plancha la línea celular diana en un plato de 6 pocillos en MEF irradiados para alcanzar el 70 a 80% de confluencia después de una incubación durante la noche. Configure la reacción de transfección como se describe. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Luego, agregue la mezcla de reacción de transfección gota sabia a las células. Después de 48 horas, prepare las celdas para la clasificación celular como anteriormente. Aproximadamente 10 días después de enchapar células individuales, utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger colonias en tubos de tira de PCR y en un pozo de una placa de 12 pozos pre-recubierta con gelatina y MEF.
Transfiera 100 microlitros de las células a cada pozo de una placa de 24 o 48 pozos, previamente recubierta con gelatina y MEF irradiado en medio ESC humano con inhibidor de ROCK. Utilice las 100 microlitros restantes para el aislamiento del ADN. Para comprobar la integración exitosa del ADN oligo de una sola cadena, tome cinco microlitros de ADN aislados de cada colonia para realizar pcR utilizando las imprimaciones de cribado previamente diseñadas.
Purificar los productos de PCR y preparar los 40 microlitros de la digestión de enzimas de restricción utilizando el sitio enzimático único creado en el ADN oligo de una sola hebra. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar a la temperatura recomendada por el fabricante durante una a tres horas. A continuación, visualice los productos de PCR digeridos añadidos con un tinte de carga en un gel de agarosa de bromuro de etidio por volumen de 1,5% de peso, electroforese a 80 a 100 voltios durante 40 minutos.
Si se ha producido una integración exitosa del ADN oligo de una sola hebra, secuenciar mutaciones específicas utilizando una imprimación anidada. En este estudio, para la construcción de ARN guía, una banda de 100 pares base fue extirpada de un gel de agarosa del 1,5%. Después de la transfección celular, se visualizó la validación del corte de ARN guía utilizando un gel de agarosa del 2,5%.
Un producto PCR de par base 180 mostró un control sin cortar y diferentes clones con turnos de banda que indican la formación de indel. Diferentes ARN guía tenían diferentes eficiencias de corte. Para evitar el re-corte CRISPR-Cas9 de los alelos editados, la secuencia PAM se modificó utilizando una mutación silenciosa de G a A.
Una mutación silenciosa en la secuencia PAM generó un sitio de restricción único, que ayuda a detectar una integración exitosa en uno o dos alelos. Las líneas de células madre editadas por el genoma se pueden utilizar en diferencias posteriores y ensayos funcionales para estudiar el efecto de una mutación dada en el desarrollo humano y la enfermedad. Esta metodología permite la generación de líneas celulares isogénicas con mutaciones heterocigotas o homocigotas específicas, implicadas en una amplia variedad de enfermedades humanas.
Estos modelos de enfermedades allanan el camino para el desarrollo de nuevas terapias celulares, así como ofrecen plataformas para el descubrimiento de fármacos.
