Gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları insan nüfusunun dışlanmış doğası tarafından engellenir. Hastaya özgü ve kontrol iPS hücre hatlarının farklı genetik arka planlar farklılaşma verimliliği ve belirli bir fonksiyonel tetkik bulunan fenotipler etkileyebilir. Tek farkın ilginin belirli mutasyonu olduğu genetik olarak özdeş veya iyojenik çizgilerin kullanımı bu sorunların üstesinden gelmek için önemlidir.
Birçok insan hastalığı, CRISPR-Cas9 sistemi ile üretilmesi zor olan heterozigot mutasyonlardan kaynaklanır. Bunun nedeni, çok yüksek frekansta meydana gelebilen hedefsiz alellerdeki indel mutasyonlarının oluşmasıdır. Tekniğimiz, sadece bir tanesinin ilgi çekici mutasyonu barındıran iki onarım şablonu kullanarak bu sorunun üstesinden gelebilmektedir.
Bu tekniği deneyen herhangi bir araştırmacı insan pluripotent kök hücre kültüründe yetenekli olmalıdır. Koloni toplama video gösteri doğru boyut ve morfoloji yanı sıra toplama ve tarama için kullanılan tekniği göstermek için yararlı olacaktır. Bu prosedürü gösteren Leo Cardenas olacaktır.
Başlamak için, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış MEFs üzerinde plaka insan ESCs. Transfection master karışımını hazırlayın. Pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreler % 70-80 biraraya ulaştığında, daha sonra, transfection master karışımı damla hücreleri ile her kuyuya akıllıca damla ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Her 24 saatte bir medyayı değiştirin. Hücreleri hasat etmek için, ilk olarak, enzimatik MEFs kaldırmak için oda sıcaklığında üç dakika boyunca Triple E ile hücreleri kuluçka.
10 mikromolar ROCK inhibitörü ile HESC orta 0,5 mililitre ekleyin. Pelet hücreleri 300 kez g üç dakika ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile insan ESC orta 0,5 mililitre yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 35 mikronluk bir süzgeç kapağından beş mililitrelik bir tüpe süzün.
Floresan aktive hücre sıralama kullanarak, canlı hücrelerüzerinde kapı ve yeşil floresan protein-pozitif hücreleri sıralamak. Daha sonra, 1-3 bazal membran matris ve ışınlanmış MEFs ve insan ESC orta ROCK inhibitörü içeren ile kaplanmış 10 santimetre lik bir çanak doğrudan dört sıralanmış hücrelere 1,5 kez 10 maksimum aktarın. ROCK inhibitörü olmadan insan ESC ortamını kullanarak her gün ortayı değiştirin.
10-15 gün sonra kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetredir. Mikroskop altında, tek bir klonu dikkatlice kazımak ve hücreleri pipetin içine çekmek için P200 pipetkullanın. Hücreleri 96 kuyuluk bir kuyuda, koloniyle birlikte hazırlanan ortamda 3-4 kez hafifçe borulandırarak dağıtın.
Sonra, her kılavuz RNA için 20 koloni seçin ve tarama için PCR şerit tüpleri içine dağıtmak. Beş dakika boyunca 10,000 kez G'de santrifüj ile hücreleri pelet. Şimdi, 20 mikrolitre proteinaz K tamponundaki hücre peletlerini kuluçkaya yatırArak DNA ve girdapları şiddetle izole edin.
Santrifüj 10,000 kez G beş dakika. Daha sonra, düzenlenmiş DNA'nın PCR taramasını gerçekleştirin. Tüpler içine 20 mikrolitre ana karışımı ekleyin, ileri ve ters astarlar da dahil olmak üzere, ilgi bölgesini yükseltmek için tasarlanmış, yanı sıra Proteinase K sindirimi beş mikrolitre.
Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için kontrol iPSC hattından izole genomik DNA kullanın. PCR ürünlerinin bir saatlik elektroforezini 70-90 volt tan sonra hacim agarose jeli ile %2,5 ağırlıkta değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.
Tek iplikçik oligo DNA'sını ve CRISPR-Cas9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, bir gecede kuluçkadan sonra %70 ila %80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın. Transfeksiyon reaksiyonu açıklandığı gibi ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.
Sonra, hücrelere akıllıca transfection reaksiyon karışımı damla ekleyin. 48 saat sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hücre sıralamaiçin hazırlayın. Tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra, 200 mikrolitrelik pipet kullanarak PCR şerit tüplere kolonileri ve jelatin ve MEF'lerle önceden kaplanmış 12 kuyulu bir plaka kuyusunun içine yerleştirin.
Daha önce jelatin ve ıŞıNlanmış MEF'ler ile daha önce kaplanmış 24 veya 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya 100 mikrolitre hücre aktarımı. DNA izolasyonu için kalan 100 mikrolitreyi kullanın. Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, her koloniden izole edilmiş beş mikrolitre DNA alın ve daha önce tasarlanmış tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirin.
PCR ürünlerini arındırın ve tek iplikçikli oligo DNA'sında oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak 40 mikrolitre kısıtlama enzimi sindirimi hazırlayın. Bir ila üç saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonkarıştırın. Daha sonra, hacim ethidium bromür agarose jel, elektrofore 80-100 volt 40 dakika ile% 1.5 ağırlık bir yükleme boya sıyrık ile eklenen sindirilmiş PCR ürünleri görselleştirin.
Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana gelir. Bu çalışmada, kılavuz RNA yapımı için 100 baz çifti bandı %1.5 agarose jelden çıkarıldı. Hücre transfeksiyonu sonrasında kılavuz RNA kesiminin doğrulaması %2.5 agarose jel kullanılarak görselleştirildi.
180 baz çifti PCR ürünü, kesilmemiş bir kontrol ve bant kaymaları ile indel oluşumunu gösteren farklı klonlar gösterdi. Farklı kılavuz RNA'ların farklı kesme verimleri vardı. CRISPR-Cas9'un düzenlenmiş alellerin yeniden kesilmesini önlemek için PAM dizisi G'den A'ya sessiz mutasyon kullanılarak değiştirildi.
PAM dizisindeki sessiz bir mutasyon, bir veya iki alelile başarılı bir entegrasyon için tarama ya da yardımcı benzersiz bir kısıtlama sitesi oluşturdu. Genomda düzenlenmiş kök hücre hatları, belirli bir mutasyonun insan gelişimi ve hastalığı üzerindeki etkisini incelemek için aşağı akım farklılaştırmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilir. Bu metodoloji, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı belirli bir heterozigot veya homozigot mutasyonlar ile izojenik hücre hatlarının oluşumunu sağlar.
Bu hastalık modelleri yeni hücresel tedavilerin geliştirilmesinin yanı sıra ilaç keşfi için platformlar da sunmaktadır.
