Изучение функции генов и болезней затрудняется выбойной природой человеческой популяции. Различные генетические фоны конкретных пациентов и контроля iPS клеточных линий может повлиять на эффективность дифференциации и фенотипов, найденных в данном функциональном анализе. Использование генетически идентичных или изогенных линий, где единственным отличием является особая мутация интереса имеет решающее значение для преодоления этих проблем.
Многие заболевания человека вызваны гетерозиготными мутациями, которые могут быть трудно генерировать с помощью системы CRISPR-Cas9. Это связано с генерацией идельных мутаций в нецелевом аллеле, которые могут происходить на очень высокой частоте. Наша техника преодолевает эту проблему, используя два шаблона ремонта, из которых только один питает мутацию интереса.
Любой исследователь пытается этот метод должен быть квалифицированным в человеческой плюрипотентной культуры стволовых клеток. Видео-демонстрация колонии сбор будет полезно, чтобы показать правильный размер и морфологии, а также метод, используемый для сбора и скрининга. Демонстрацией этой процедуры будет Лео Карденас.
Для начала, пластины человека ESCs на облученных MEFs в 6-хорошо пластины. Подготовка трансфекции мастер смеси. Смешайте с помощью пипетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Когда клетки достигают 70 до 80% слияния, то, добавить трансфекции мастер смесь падение мудрым, чтобы каждый хорошо с клетками и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов. Меняются средства массовой информации каждые 24 часа. Для сбора клеток, во-первых, инкубировать клетки с Triple E в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы удалить MEFs enzymatically.
Добавьте 0,5 миллилитров среды HESC с 10 микромолейными ингибиторами ROCK. Пеллетные клетки по 300 раз г в течение трех минут и повторно приостановить в 0,5 миллилитров человека ESC среды с 10 микромолярный ингибитор ROCK. Фильтровать подвеску клетки в пятими миллилитровую трубку через крышку 35 микроин-клеток.
Используя флуоресценцию активированную сортировку клеток, ворота на живых клетках и сортируют зеленые флуоресцентные белково-положительные клетки. Затем перенесите максимум 1,5 раза 10 раз в четыре отсортированные клетки непосредственно в 10-сантиметровое блюдо, покрытое одной-тремя мембранными матрицами подвала и облученными МЭФ и человеческой средой ESC, содержащей ингибитор ROCK. Изменение среды ежедневно с помощью человека ESC среды без ингибитора ROCK.
Через 10-15 дней диаметр колоний составляет примерно от одного до двух миллиметров. Под микроскопом используйте пипетки P200, чтобы тщательно соскребать один клон и втянуть клетки в пипетки. Разогнать клетки в колодец 96-хорошо пластины, мягко трубы три-четыре раза в среде составлен с колонией.
Затем выберите 20 колоний для каждого руководства РНК и обойтись в ПЦР полосы труб для скрининга. Пеллет клетки центрифугации на 10000 раз G в течение пяти минут. Теперь инкубировать клеточные гранулы в 20 микролитров буфера Proteinase K, чтобы изолировать ДНК и вихрь энергично.
Центрифуга при 10 000 Г в течение пяти минут. Далее выполните скрининг ПЦР отредактированной ДНК. Добавьте в трубки 20 микролитров мастер-микса, в том числе вперед и наоборот грунтовки, предназначенные для усиления области интереса, а также пять микролитров дайджеста Proteinase K.
Используйте геномную ДНК, изолированную от линии управления iPSC, чтобы подтвердить чистый ампликон при выполнении скринингового ПЦР. Оцените изменения размера продуктов ПЦР после одного часа электрофорез на 70 до 90 вольт на 2,5% веса по объему агарозного геля. Любая разница в размерах свидетельствует о расщеплении.
Чтобы трансфект одной нити олиго ДНК и CRISPR-Cas9 плазмидов, пластины целевой линии клеток в 6-хорошо блюдо на облученных MEFs достичь 70 до 80% слияния после более чем на ночь инкубации. Настройка реакции трансфекции, как описано. Смешайте реакцию с помощью пипетки и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
Затем добавьте трансфекции реакции смеси падение мудрым в клетки. После 48 часов, подготовить клетки для сортировки клеток, как и раньше. Примерно через 10 дней после покрытия одиночных ячеек, используйте 200 микролитр пипетки, чтобы выбрать колонии в ПЦР полосы труб и в колодец 12-хорошо пластины предварительно покрыты желатином и MEFs.
Перенесите 100 микролитров клеток в каждую колодец 24 или 48-колодец пластины, ранее покрытой желатином и облученных МЭФ в среде ESC человека с ингибитором ROCK. Используйте оставшиеся 100 микролитров для изоляции ДНК. Чтобы проверить успешную интеграцию одной нити олиго ДНК, возьмите пять микролитров ДНК изолированы от каждой колонии для выполнения ПЦР с помощью скрининга грунтовки ранее разработанных.
Очистить продукты ПЦР и подготовить 40 микролитров ограничения фермента пищеварения с использованием уникального фермента сайт, созданный в одной нити олиго ДНК. Смешайте реакцию с помощью труб и инкубировать при рекомендованной производителем температуре в течение одного-трех часов. Затем визуализуйте переваренные продукты ПЦР, добавленные с погрузочным красителем на 1,5% веса по объему этидия бромидного агарозного геля, электрофореза на 80-100 вольт в течение 40 минут.
В случае успешной интеграции одной нити олиго ДНК произошло, последовательность конкретных мутаций с помощью вложенных грунтовки. В этом исследовании, для руководства РНК строительства, 100 базовых пара полоса была вырезана из 1,5%agarose гель. После трансфекции клеток, проверка направляющий РНК резки была визуализирована с помощью 2,5%agarose гель.
180 базовая пара PCR продукт показал необрезанный контроль и различные клоны с полосой сдвиги, указывающие на формирование indel. Различные руководства РНК имели различную эффективность резки. Чтобы избежать повторного разрезания отредактированных аллелей CRISPR-Cas9, последовательность PAM была изменена с помощью бесшумной мутации G to A.
Тихая мутация в последовательности PAM создала уникальный сайт ограничения, который помогает экранировать для успешной интеграции в один или два аллеля. Линии стволовых клеток, отредактированные геномом, могут быть использованы в дифференциациях и функциональных анализах ниже по течению для изучения влияния данной мутации на развитие человека и болезни. Эта методология позволяет генерации изогенных клеточных линий с определенными гетерозиготными или гомозиготными мутациями, замешанными в самых разнообразных заболеваниях человека.
Эти модели болезней прокладывают путь для разработки новых клеточных методов лечения, а также предлагают платформы для открытия лекарств.
