وتعرقل دراسة وظيفة الجينات والمرض من الطبيعة الأصيلة للسكان البشر. الخلفيات الجينية المختلفة من المريض محددة والسيطرة على خطوط الخلايا iPS يمكن أن تؤثر على كفاءة التمايز والأنماط الظاهرية الموجودة في اختبار وظيفية معينة. استخدام خطوط متطابقة وراثيا أو isogenic حيث الفرق الوحيد هو طفرة معينة من الاهتمام أمر بالغ الأهمية للتغلب على هذه القضايا.
ويتسبب العديد من الأمراض البشرية من الطفرات heterozygous، والتي يمكن أن يكون من الصعب توليد مع نظام كريسبر-Cas9. ويرجع ذلك إلى توليد طفرات إندل في أليل غير المستهدفة التي يمكن أن تحدث على تردد عال جدا. أسلوبنا يتغلب على هذه المشكلة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط المرافئ طفرة الفائدة.
أي محقق يحاول هذه التقنية يجب أن تكون ماهرة في ثقافة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. سوف مظاهرة الفيديو من قطف مستعمرة تكون مفيدة لإظهار الحجم الصحيح ومورفولوجيا فضلا عن تقنية تستخدم في الانتقاء والفرز. إثبات هذا الإجراء سيكون ليو كارديناس.
للبدء، لوحة ESCs الإنسان على MEFs المشعة في لوحة 6-جيدا. إعداد المزيج الرئيسي transfection. تخلط عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء، ثم، إضافة المزيج سيد transfection إسقاط الحكمة إلى كل بئر مع الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تغيير الوسائط كل 24 ساعة. لحصاد الخلايا، أولاً، احتضان الخلايا مع الثلاثي E لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة MEFs الأنزيمية.
إضافة 0.5 ملليلتر من HESC المتوسطة مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. خلايا بيليه في 300 مرة ز لمدة ثلاث دقائق وإعادة تعليق في 0.5 ملليلتر من وسط ESC الإنسان مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة. تصفية تعليق الخلية في أنبوب خمسة ملليلتر من خلال 35 ميكرون مصفاة الخلية الغطاء.
باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلوريسنس، بوابة على الخلايا الحية وفرز الخلايا الخضراء البروتينية الإيجابية. بعد ذلك، نقل بحد أقصى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الأربع فرزها مباشرة إلى طبق 10 سم المغلفة مع 1-3 مصفوفة غشاء الطابق السفلي وMFs المشعة وSES الإنسان المتوسط التي تحتوي على مثبط روك. تغيير متوسط يوميا باستخدام وسيلة ESC الإنسان دون مثبطات روك.
بعد 10 إلى 15 يوما، المستعمرات ما يقرب من واحد إلى اثنين ملليمتر في القطر. تحت المجهر، استخدم ماص P200 لكشط بعناية استنساخ واحد ورسم الخلايا في الماصات. تفريق الخلايا في بئر من لوحة 96-جيدا عن طريق الأنابيب بلطف ثلاث إلى أربع مرات في المتوسطة وضعت مع المستعمرة.
ثم، واختيار 20 مستعمرات لكل رنا دليل والاستغناء في أنابيب الشريط PCR للفحص. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 10، 000 مرة G لمدة خمس دقائق. الآن، الكريات خلية احتضان في 20 ميكرولترات من البروتينات K العازلة لعزل الحمض النووي ودوامة بقوة.
جهاز طرد مركزي في 10،000 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء فحص PCR للحمض النووي المحرر. إضافة إلى أنابيب 20 ميكرولترات من مزيج رئيسي، بما في ذلك التمهيديات إلى الأمام وعكس، مصممة لتضخيم المنطقة ذات الاهتمام، فضلا عن خمسة ميكرولترات من هضم البروتينات K.
استخدام الحمض النووي الجينومي معزولة عن خط iPSC التحكم للتأكد من أمبيركون نظيفة عند إجراء الفحص PCR. تقييم التغيرات حجم منتجات PCR بعد ساعة واحدة من الكهرباء في 70 إلى 90 فولت على 2.5٪ الوزن من قبل حجم agarose هلام. أي فرق حجم يدل على الانقسام.
لtransfect الحمض النووي oligo حبلا واحد وS CRISPR-Cas9 plasmids، لوحة خط الخلية المستهدفة في طبق 6-جيدا على MEFs المشعة للوصول إلى 70 إلى 80٪ التقاء بعد أكثر من حضانة بين عشية وضحاها. إعداد رد فعل transfection كما هو موضح. اخلط رد الفعل عن طريق التنميب واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم، إضافة الخليط التفاعل transfection إسقاط الحكمة إلى الخلايا. بعد 48 ساعة، قم بإعداد الخلايا لفرز الخلايا كما كان سابقاً. حوالي 10 أيام بعد طلاء الخلايا الفردية، واستخدام ماصة 200 ميكرولتر لاختيار المستعمرات في أنابيب قطاع PCR وإلى بئر من لوحة 12 جيدا المغلفة مسبقا مع الجيلاتين وMIFs.
نقل 100 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بئر من 24 أو 48 جيدا لوحة، المغلفة سابقا مع الجيلاتين وMIFs المشعة في المتوسط ESC الإنسان مع مثبط روك. استخدم الـ 100 ميكرولترات المتبقية لعزل الحمض النووي. للتحقق من التكامل الناجح للحمض النووي القلوي الخيط واحد، واتخاذ خمسة ميكرولترات من الحمض النووي معزولة عن كل مستعمرة لأداء PCR باستخدام التمهيديات الفرز المصممة سابقا.
تنقية المنتجات PCR وإعداد 40 ميكرولتررس من هضم الانزيم تقييد باستخدام موقع انزيم فريدة من نوعها التي تم إنشاؤها في الحمض النووي oligo حبلا واحد. اخلط رد الفعل عن طريق الخفقان واحتضان درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. ثم، تصور المنتجات PCR هضم إضافة مع صبغة التحميل على 1.5٪ الوزن من قبل حجم ethidium بروميد agarose هلام، الكهرباء في 80 إلى 100 فولت لمدة 40 دقيقة.
إذا كان التكامل الناجح للحمض النووي القلاة وحيد قد حدث، تسلسل طفرات محددة باستخدام التمهيدي متداخلة. في هذه الدراسة، للحصول على دليل RNA البناء، تم استئصال 100 قاعدة زوج الفرقة من هلام agarose 1.5٪. بعد transfection الخلية، تم تصور التحقق من صحة دليل قطع الحمض النووي الريبي باستخدام هلام agarose 2.5٪.
وأظهر 180 قاعدة زوج PCR المنتج سيطرة غير المصقول والمستنسخات المختلفة مع التحولات الفرقة تشير إلى تشكيل indel. وكان دليل مختلف RNAs مختلف كفاءات القطع. لتجنب كريسبر كاس9 إعادة قص من أليلات تحريرها، تم تعديل تسلسل PAM باستخدام G إلى A الطفرة الصامتة.
ولدت طفرة صامتة في تسلسل PAM موقع تقييد فريد ، مما يساعد على فحص الاندماج الناجح في واحد أو اثنين من الغيلان. ويمكن استخدام خطوط الخلايا الجذعية المحررة من الجينوم في تمايزات المصب والاختزال الوظيفي لدراسة تأثير طفرة معينة على التنمية البشرية والمرض. تسمح هذه المنهجية بتوليد خطوط خلايا ايزوجينية مع طفرات غير مغايرة أو طفرات هُمازيغو، متورطة في مجموعة واسعة من الأمراض البشرية.
هذه النماذج المرض تمهد الطريق لتطوير علاجات الخلوية الجديدة، فضلا عن منصات العرض لاكتشاف المخدرات.
