הפרוטוקול שלנו מתגבר על חלון הדמיה bioluminescence מוגבל על ידי הכללת תג GFP אשר גם מקל על איתור וכימות של micrometastasis על ידי ניתוח PCR. מכיוון שתג GFP עוקף את חלון רכישת הביולומינציה המוגבל, ניתן לדמיין נושאים נוספים ללא אובדן האות והפוטנציאל לתוצאות שליליות שגויות מוגבל. מחקר זה יהיה שימושי לחוקרים להערכת היעילות הטיפולית של סוכנים נגד סרטן.
מתודולוגיה זו מספקת מודל שימושי עבור חוקרים המעוניינים EMT, עמידות לתרופות, ומנגנוני תאי גזע סרטניים הקשורים לתהליך גרורתי, כמו גם לפיתוח תרופות נגד סרטן. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, ספוגית בלוטת החלב הרביעית השמאלית עם אלכוהול ולהשתמש מדפים שן עכברוש בסדר להרים את בלוטת החלב הרביעית מעט. מוודאים שהטיפ משופע, מכניסים מחט של 25 מד המחוברת למזרק מיליליטר אחד המכיל 100 מיקרוליטרים של תערובת מטריצת קרום מרתף תאים ומעט חוזרים בוכנה כדי לוודא שהמחט לא תיצור קשר עם כלי דם.
לקבלת תוצאות השוואתיות, אתר הזרקת התאים הגידוליים חייב להיות עקבי בין כל בעלי החיים המטופלים. אם אין דם נכנס המזרק, לאט להזריק את כל נפח הפתרון לתוך כרית שומן חלבי. מסה מוגבהת עגולה תופיע מתחת לעור.
המתן 10 עד 15 שניות עד שמטריצת קרום המרתף תתקשה לפני הסרת המחט ותאפשר לשנאת הזרים לגדול בחופשיות ללא הפרעה במשך שבעה עד עשרה ימים לפני ביצוע מדידת גודל הגידול. לאחר מכן השתמש calipers כדי למדוד את גודל xenograft בכל העכברים ולקבוע את נפח הגידול באמצעות המשוואה כפי שצוין. לפני הדמיה של חיות המחקר, תמונה שלושה גידולים נוספים הנושאים עכברים במשך 40 דקות במרווחים של שתי דקות באמצעות הפרמטרים כפי שצוין כדי להשיג את הקינטיקה לוציפרין למחקר.
השתמש באות הביולומינציה שנמדד בשיא כדי להגדיר את חלון הזמן האופטימלי לרכישת תמונה עבור כל נקודות הזמן הבאות. כדי לבצע הדמיית גרורות, לכסות את הגידול העיקרי עם שרוול לחתוך מכפפה שחורה ולהחמין עכבר הרדמה לתוך הסורק ואז תמונה אות לוציפרין באמצעות אותם פרמטרים כפי שהודגם רק עם הצד הגחוני של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה גרורות ריאות ואת הצד הגבי של העכבר מול המצלמה עבור הדמיה גרורות המוח. באמצעות סורק ותוכנה לניתוח נתונים, צייר אזור עניין על פני האזור הדמיוני כדי להבטיח שכל איבר העניין יכסה כדי לאפשר הערכה של הנטל גרורתי ולכומת את פלט הביולומינציה כשטף הכולל והפוטונים לשנייה.
מיד לאחר כימות אותות ביולומינציה, לקצור את המוח ואת רקמת הריאה במהירות לשטוף את האיברים PBS כדי להסיר את כל כתמי הדם השטחיים. הנח את האיברים על צלחת פלסטיק שחורה פלואורסצנטית אוטומטית נמוכה והעבר את הדגימות לסורק פלואורסצנטי רב-ספקטרלי המצויד ביכולת ספקטרלית בלתי מעורערת לגילוי GFP. כדי לרכוש תמונות GFP רב ספקטרליות של האיברים שחולצו, לסרוק את האיברים מ 500 עד 720 ננומטר עם גודל צעד של 10 ננומטר.
כדי להשיג פרופיל פלואורסצנטיות אוטומטית של רקמות, סרוק איברים ממורקים של עכברי בקרה לא מופקדים. בנוסף, תמונה GFP רקמות חיוביות כגון הגידול העיקרי לרכוש פרופיל GFP מעורב פלואורסצנטי אוטומטי. עבד ספקטרום זה לפי פרוטוקול היצרן כדי להקים ספרייה ספקטרלית עם GFP טהור ופרופילי פלואורסצנטיות אוטומטית.
לאחר אישור הדיוק של הספרייה הספקטרלית והפרדת אות GFP מרקע פלואורסצנטי אוטומטי של רקמות, השתמש באותה ספריה כדי לבטל את כל התמונות במחקר. לחילוץ DNA לאחר הקפאת הצמד, מניחים את המוח כולו בצינור הומוגניזציה חמישה מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חיץ תמוגה DNA ולהשתמש homogenizer להגדיר 50 כדי הומוגניזציה של הרקמה. כאשר הרקמה כבר הומוגנית לחלוטין, להעביר מיליליטר אחד של ליסט ל DNAse ו RNAse חינם שני צינור מיקרוצנטריפוגה מיליליטר ולבודד את ה-DNA על פי פרוטוקול היצרן.
מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 100% אתנול לבידוד ומערבבים את הדגימה על ידי היפוך. לאחר שלוש דקות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את משקע הדנ"א דמוי הצמר לצינור חדש של שני מיליליטר DNAse ו-RNAse. תן לאוויר המדגם להתייבש במשך דקה אחת לפני הוספת מיליליטר אחד של 75% אתנול לצינור והפך את הצינור שלוש עד שש פעמים כדי לשטוף את הדגימה.
השליכו את האתנול לאחר ההיפוך האחרון לפני שטיפת הדנ"א פעמיים נוספות עם אתנול טרי לכל שטיפה כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, האוויר מייבש את הדגימה למשך 10 שניות לפני המסת הדנ"א ב-52 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד של שמונה מילימולרים. מעבירים שני מיקרוליטרים של דנ"א לבקבוקון ספקטרופוטומטר וכמתו את ריכוז הדנ"א בדגימה באמצעות יחס ספיגה בין A260 ל-280 לפי הנוסחה.
התאם את ריכוז הדנ"א של המדגם ל-50 ננוגרם למיקרוליטר עם נתרן הידרוקסיד נוסף של שמונה מילימולרים ותכנן את זוג הפריימר הספציפי לרצף GFP הירוק האקסוגני בבית באמצעות פורטל אינטרנט לעיצוב פריימר בקוד פתוח לגילוי PCR בזמן אמת של תג GFP ותאים גרורתיים שפלשו ויישבו את אתרי הדיסטל של הגידול. לאחר מכן השתמש בריג'נט PCR מהיר בזמן אמת ובמכונת PCR בזמן אמת התומכת בפרוטוקול PCR מהיר בזמן אמת לניתוח PCR כמותי בזמן אמת של המדגם. לגילוי תאים גרורתיים של סרטן השד בריאה, השתמש במספריים לנתח כדי לפתוח את חלל החזה לחתוך בעבר את הלב ואת התימוס כדי לחשוף את קנה הנשימה.
הכנס מחט 22 מד מחובר מזרק 10 מיליליטר המכיל פתרון Bouin לתוך קנה הנשימה ולדכא את הבוכנה עד הריאות התמוטט להיות נפוח עם כשני מיליליטר של הפתרון. הסר את המזרק ואת המחט פעם הריאות כבר מנופח ולהעביר את הריאה כולה לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל פתרון Bouin טרי. בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לפני שעזב את הרקמה כדי להשרות במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
למחרת, לשטוף את הריאה עם מים ולהניח את הדגימה לתוך צינור של 70% אתנול. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ לנתח כדי לספור את מספר כתמים לבנים גרורתיים וגוונים על פני השטח של הריאות. מדידת נפח הגידול על ידי caliper היא שיטה מבוססת היטב להערכת יעילות הטיפול.
כדי להשיג אותות דומים בין קבוצות מחקר, מחקר קינטיקה BLI טרום הדמיה חייב להתבצע כדי לקבוע את מסגרת הזמן הדמיה הטובה ביותר. בשל יחס אות-לרקע מעולה, כל הגוף ב- vivo BLI רגיש למדי בזיהוי אותות גרורות ברמה נמוכה בהשוואה לגישת GFP. עם זאת, בשל האופי היציב של מולקולת GFP, לחוקרים יש מספיק זמן לעבד את הפגר לפני לכידת אותות GFP מאיברי המטרה במחקרים כפולים.
דוגמה זו לחיים האמיתיים מדגימה כיצד מדידות גודל הגידול caliper יכול לעוות את פרשנות הנתונים כמו xenograft זה איבד את רוב התוכן תא הגידול קיימא תוך שמירה על המסה הגדולה שלה ואת הצורה. זיהוי מולקולרי על ידי PCR בזמן אמת יכול גם לספק ראיות משכנעות של גרורות במוח במודל סרטן השד אורתוטופי באמצעות ריצוף DNA GFP אקסוגני כמו רצף DNA GFP מנומר אינו קיים באופן טבעי בבני אדם או מכרסמים. אתר ההשתלה צריך להיות קשור מבחינה פיזיולוגית ואנטומית ממאירות סרטן.
ניתן להעריך הן את הגן הגידול והן את ביטוי החלבון באתרים ראשוניים דיסטליים ותאים גרורתיים יכולים להיות מבודדים לאפיון נוסף.
