当社のプロトコルは、PCR分析による微小転移の検出と定量化を容易にするGFPタグを含めることで、限られた生物発光イメージングウィンドウを克服します。GFPタグは限られた生物発光獲得ウィンドウを回避するため、信号損失なしでより多くの被験者を画像化することができ、偽陰性の結果の可能性は限られている。この研究は、抗がん剤の治療効果の評価に役立つ研究者に有用であろう。
この方法論は、EMT、薬剤耐性、および転移過程に関連する癌幹細胞機構および抗癌薬の開発に関心を持つ研究者に有用なモデルを提供する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、アルコールで左4番目の乳腺をスワブし、細かいラット歯の鉗子を使用して4番目の乳腺をわずかに持ち上げる。先端がベベルアップされていることを確認し、細胞基膜マトリックスミックスの100マイクロリットルを含む1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージ針を挿入し、針が血管に接触しないことを確認するためにプランジャーをわずかに引き込みます。
比較結果のために、腫瘍細胞注入部位は、すべてのレシピエント動物間で一貫している必要があります。血液が注射器に入らない場合は、溶液の全容を乳腺脂肪パッドにゆっくりと注入する。丸い盛り上がった塊が皮膚の下に現れます。
基部膜マトリックスが硬化してから針を取り除き、異種移植片が腫瘍サイズ測定を行う前に7〜10日間中断することなく自由に成長できるように10〜15秒待ちます。次に、キャリパーを使用して、すべてのマウスにおける異種移植片のサイズを測定し、示された式を使用して腫瘍体積を決定する。研究動物をイメージングする前に、研究のためのルシフェリン動態を得るために示されたパラメータを使用して、2分間間隔で40分間、3つの追加の腫瘍軸受マウスを画像化する。
ピーク測定された生物発光信号を使用して、後続のすべての時点に最適な画像取得時間を定義します。転移イメージングを行うために、黒い手袋から切り取られたスリーブで原発腫瘍を覆い、麻酔薬をスキャナに入れ、肺転移イメージングのためにカメラに向かうマウスの腹側と脳転移のためにカメラに面したマウスの側と同じパラメータを使用してルシフェリン信号を画像化します。スキャナとデータ解析ソフトウェアを使用して、画像化された領域に関心領域を描画して、対象となる臓器全体をカバーし、転移性負担の評価を可能にし、生物発光出力を毎秒の総フラックスおよび光子として定量化します。
生物発光シグナル定量後すぐに、脳と肺組織を収穫し、PBSの臓器を素早く洗い流して表面的な血液汚れを取り除きます。低い自己蛍光黒いプラスチック板の上に器官を置き、GFPの検出のためのスペクトルの非混合機能が装備されている多分スペクトル蛍光スキャナにサンプルを運ぶ。抽出した臓器のマルチスペクトルGFP画像を取得するには、10ナノメートルのステップサイズで500〜720ナノメートルの臓器をスキャンします。
組織の自己蛍光プロファイルを得るために、未注入制御マウスの切除器官をスキャンする。さらに、画像GFP陽性組織、例えば原発性腫瘍のような、自己蛍光混合GFPプロファイルを取得する。これらのスペクトルをメーカーのプロトコルに従って処理し、純粋なGFPおよび自動蛍光プロファイルを備えたスペクトルライブラリを確立します。
スペクトルライブラリの精度を確認し、GFP信号を組織自動蛍光の背景から分離した後、同じライブラリを利用して研究上のすべての画像をアンミックスする。スナップ凍結後のDNA抽出のために、2ミリリットルのDNAリシスバッファーを含む5ミリリットル均質化チューブに脳全体を入れ、ホモジナイザーを50にセットして組織を均質化します。組織が完全に均質化されたら、1ミリリットルのライゼをDNAAseおよびRNAseフリー2ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、製造業者のプロトコルに従ってDNAを単離する。
100%エタノールの500マイクロリットルを分離物に加え、反転によってサンプルを混合する。室温で3分後、ピペットを使用して、ウール様DNA沈殿物を新しい2ミリリットルのDNAAseおよびRNAseフリーチューブに移します。サンプルの空気を1分間乾燥させてから、75%エタノールの1ミリリットルをチューブに加え、チューブを3~6回反転させてサンプルを洗浄します。
最後の反転後にエタノールを捨ててから、DNAを洗浄ごとに新鮮なエタノールでさらに2回洗浄します。最後の洗浄後、サンプルを10秒間乾燥させてから、DNAを52マイクロリットルの水酸化ナトリウムを52マイクロリットルで溶解します。2マイクロリットルのDNAアリコートを分光光度計バイアルに移し、式に従ってA260と280の間の吸光度比を使用してサンプル中のDNAの濃度を定量化する。
追加の8ミリモル水酸化ナトリウムでサンプルのDNA濃度をマイクロリットル当たり50ナノグラムに調整し、GFPタグと腫瘍の遠位部位に侵入してコロニー形成した転移細胞のリアルタイムPCR検出のためのオープンソースプライマー設計ウェブポータルを使用して、外因性の緑色GFP配列に固有のプライマーペアを社内で設計します。次に、高速リアルタイム PCR 試薬と、サンプルのリアルタイム定量 PCR 分析に高速リアルタイム PCR プロトコルをサポートするリアルタイム PCR マシンを使用します。肺の転移性乳癌細胞の検出には、切除ハサミを使って胸腔を開き、心臓と胸腺を切り抜いて気管を露出させる。
ブイン溶液を含む10ミリリットルの注射器に取り付けられた22ゲージの針を気管に挿入し、崩壊した肺が溶液の約2ミリリットルで腫れるまでプランジャーを押し下げ。肺が膨張したら注射器と針を取り出し、肺全体を新鮮なブイン溶液を含む15ミリリットルのチューブに移します。組織を残す前にチューブを数回軽く反転させ、室温で24時間浸します。
翌日、肺を水ですすい、試料を70%エタノールのチューブに入れます。次に、解剖顕微鏡を使用して、肺の表面上の転移性白色パッチと結節の数を数えます。キャリパーによる腫瘍体積測定は、治療効果を評価するための十分に確立された方法である。
研究グループ間で同等のシグナルを得るには、イメージング前のBLIキネティクス研究を行い、最良のイメージング時間枠を決定する必要があります。優れた信号対バックグラウンド比により、生体内BLIの全身はGFPアプローチに比べて低レベル転移信号の検出に非常に敏感です。しかし、GFP分子の安定した性質のために、研究者はデュアルレポーター研究で標的臓器からGFP信号を捕捉する前に死体を処理するのに十分な時間を持っています。
この実生活の例は、キャリパー腫瘍サイズ測定が、この異種移植片が大きな質量と形状を維持しながら生存可能な腫瘍細胞含有量のほとんどを失ったとして、データ解釈を歪める方法を示しています。リアルタイムPCRによる分子検出は、ヒトやげっ歯類に自然に存在しないGFPDNA配列が外因性GFPDNAシーケンシングを用いた交感性乳癌モデルにおける脳転移の説得力のある証拠を提供することもできる。移植部位は、癌の悪性腫瘍に生理学的および解剖学的に関連するべきである。
腫瘍遺伝子およびタンパク質発現の両方を、一次および遠位部位で評価することができ、転移性細胞は、さらなる特徴付けのために単離することができる。
