Unser Protokoll überwindet das begrenzte Biolumineszenz-Bildgebungsfenster durch die Aufnahme eines GFP-Tags, das auch die Detektion und Quantifizierung von Mikrometastasen durch PCR-Analyse erleichtert. Da das GFP-Tag das begrenzte Biolumineszenzerfassungsfenster umgeht, können mehr Motive ohne Signalverlust abgebildet werden und das Potenzial für falsche negative Ergebnisse ist begrenzt. Diese Studie wird für Forscher für die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von Krebsmedikamenten nützlich sein.
Diese Methode bietet ein nützliches Modell für Forscher, die an EMT, Medikamentenresistenz und Krebsstammzellmechanismen im Zusammenhang mit dem metastasierenden Prozess sowie für die Entwicklung von Krebsmedikamenten interessiert sind. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflex bestätigt haben, wischen Sie die linke vierte Brustdrüse mit Alkohol ab und verwenden Sie feine Rattenzahnzange, um die vierte Brustdrüse leicht zu heben. Stellen Sie sicher, dass die Spitze abschrägt ist, legen Sie eine 25-Spur-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze mit 100 Mikroliter Zellkeller-Membran-Matrix-Mix befestigt und leicht zurückziehen den Kolben, um sicherzustellen, dass die Nadel keine Blutgefäße kontaktiert.
Für Vergleichsergebnisse muss die Tumorzellinjektionsstelle zwischen allen Empfängertieren konsistent sein. Wenn kein Blut in die Spritze gelangt, injizieren Sie langsam das gesamte Volumen der Lösung in das Brustfettpad. Unter der Haut erscheint eine runde erhöhte Masse.
Warten Sie 10 bis 15 Sekunden, bis die Kellermembranmatrix aushärtet, bevor sie die Nadel entfernt, und lassen Sie das Xenograft sieben bis zehn Tage lang ununterbrochen frei wachsen, bevor eine Tumorgrößenmessung durchgeführt wird. Verwenden Sie dann Sättel, um die Größe des Xenografts in allen Mäusen zu messen und das Tumorvolumen mit der angegebenen Gleichung zu bestimmen. Vor der Abbildung der Studientiere, Bild drei zusätzliche Tumor tragende Mäuse für 40 Minuten in Zwei-Minuten-Intervallen mit den Parametern, wie angegeben, um die Luziferin-Kinetik für die Studie zu erhalten.
Verwenden Sie das spitzengemessene Biolumineszenzsignal, um das optimale Bildaufnahmezeitfenster für alle nachfolgenden Zeitpunkte zu definieren. Um metastasierende Bildgebung durchzuführen, decken Sie den primären Tumor mit einer Hülse, die aus einem schwarzen Handschuh geschnitten wird, und legen Sie eine anästhesierte Maus in den Scanner, und stellen Sie dann das Luziferinsignal mit den gleichen Parametern ab, wie sie gerade mit der ventralen Seite der Maus zur Darstellung der Lungenmetastasierung und der dorsalen Seite der Maus zur Bildgebung der Gehirnmetastasen gezeigt wurden. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Scanners und einer Datenanalysesoftware einen Bereich von Interesse über den abgebildeten Bereich, um sicherzustellen, dass das gesamte Interessenskörper abgedeckt wird, um die Bewertung der metastasierenden Belastung zu ermöglichen und die Biolumineszenzleistung als Gesamtfluss und Photonen pro Sekunde zu quantifizieren.
Unmittelbar nach der Biolumineszenz Signal Quantifizierung, ernten Sie das Gehirn und Lungengewebe und schnell spülen die Organe in PBS, um alle oberflächlichen Blutflecken zu entfernen. Legen Sie die Organe auf eine schwarze Kunststoffplatte mit niedriger Autofluoreszenz und transportieren Sie die Proben zu einem multispektralen Fluoreszenzscanner, der mit spektraler Unmischungsfunktion zur GFP-Erkennung ausgestattet ist. Um multispektrale GFP-Bilder der extrahierten Organe zu erfassen, scannen Sie die Organe von 500 bis 720 Nanometern mit einer Schrittgröße von 10 Nanometern.
Um ein Autofluoreszenzprofil zu erhalten, scannen Sie ausgeschnittene Organe von nicht injizierten Kontrollmäusen. Zusätzlich, Bild GFP-positive Gewebe wie Primärtumor, um Autofluoreszenz gemischte GFP-Profil zu erwerben. Verarbeiten Sie diese Spektren gemäß dem Herstellerprotokoll, um eine Spektralbibliothek mit reinen GFP- und Autofluoreszenzprofilen einzurichten.
Nach der Bestätigung der Genauigkeit der Spektralbibliothek und der Trennung von GFP-Signal von Gewebe auto Fluoreszenz Hintergrund, verwenden Sie die gleiche Bibliothek, um alle Bilder auf Studie zu entmischen. Für die DNA-Extraktion nach dem Einfrieren des Drucks legen Sie das gesamte Gehirn in eine fünf Milliliter homogenisierende Röhre mit zwei MilliliterN DNA-Lysepuffer und verwenden Sie einen Homogenisator auf 50, um das Gewebe zu homogenisieren. Wenn das Gewebe vollständig homogenisiert ist, übertragen Sie einen Milliliter des Lysats in ein DNAse- und RNAse-freies Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und isolieren Sie die DNA gemäß dem Herstellerprotokoll.
500 Mikroliter 100% Ethanol in das Isolat geben und die Probe durch Inversion mischen. Nach drei Minuten bei Raumtemperatur verwenden Sie eine Pipette, um den wollartigen DNA-Ausfall auf ein neues Zwei-Milliliter-DNAse- und RNAse-freies Rohr zu übertragen. Lassen Sie die Probe luft für eine Minute trocknen, bevor Sie einen Milliliter 75% Ethanol in das Rohr geben und das Rohr drei- bis sechsmal invertieren, um die Probe zu waschen.
Entsorgen Sie das Ethanol nach der letzten Inversion, bevor Sie die DNA noch zwei Mal mit frischem Ethanol pro Waschgang waschen, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche trocknen Sie die Probe 10 Sekunden lang an der Luft, bevor sie die DNA in 52 Mikroliter mit acht Millimolar-Natriumhydroxid auflöst. Übertragen Sie ein zwei Mikroliter-Aliquot von DNA auf eine Spektralphotometer-Durchstechflasche und quantifizieren Sie die Konzentration der DNA in der Probe unter Verwendung eines Absorptionsverhältnisses zwischen A260 und 280 nach der Formel.
Stellen Sie die DNA-Konzentration der Probe auf 50 Nanogramm pro Mikroliter mit zusätzlichem acht Millimolaren Natriumhydroxid ein und entwerfen Sie das grundierte Paar spezifisch für die exogene grüne GFP-Sequenz im eigenen Haus mit einem Open-Source-Primer-Design-Webportal für die Echtzeit-PCR-Erkennung des GFP-Tags und der metastasierenden Zellen, die in die distalen Stellen des Tumors eingedrungen sind und sie besiedelt haben. Verwenden Sie dann ein schnelles Echtzeit-PCR-Reagenz und eine Echtzeit-PCR-Maschine, die ein schnelles Echtzeit-PCR-Protokoll für die quantitative PCR-Analyse der Probe in Echtzeit unterstützt. Für den Nachweis von metastasierenden Brustkrebszellen in der Lunge, verwenden Sie sezieren Schere, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie vorbei an Herz und Thymus, um die Luftröhre zu belichten.
Legen Sie eine 22-Spur-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze mit Bouin-Lösung befestigt ist, in die Luftröhre ein und drücken Sie den Kolben, bis die zusammengebrochene Lunge mit etwa zwei Millilitern der Lösung angeschwollen ist. Entfernen Sie die Spritze und die Nadel, sobald die Lunge aufgeblasen wurde, und übertragen Sie die gesamte Lunge in ein 15-Milliliter-Rohr mit frischer Bouin-Lösung. Umkehren Sie das Rohr ein paar Mal vorsichtig, bevor Sie das Gewebe 24 Stunden bei Raumtemperatur einweichen lassen.
Am nächsten Tag die Lunge mit Wasser abspülen und die Probe in eine Röhre mit 70% Ethanol geben. Verwenden Sie dann ein Sezieren des Mikroskops, um die Anzahl der metastasierenden weißen Flecken und Knötchen auf den Oberflächen der Lunge zu zählen. Die Tumorvolumenmessung per Bremssattel ist eine etablierte Methode zur Beurteilung der Behandlungswirksamkeit.
Um vergleichbare Signale zwischen den Studiengruppen zu erhalten, muss eine vor-imaging BLI-Kinetik-Studie durchgeführt werden, um den besten Bildgebungszeitrahmen zu bestimmen. Aufgrund des überlegenen Signal-Hintergrund-Verhältnisses ist der Ganzkörper in vivo BLI im Vergleich zum GFP-Ansatz sehr empfindlich bei der Erkennung von Metastasensignalen mit niedrigem Niveau. Aufgrund der stabilen Natur des GFP-Moleküls haben die Forscher jedoch genügend Zeit, um den Kadaver zu verarbeiten, bevor sie die GFP-Signale von Zielorganen in Dual-Reporter-Studien erfassen.
Dieses Beispiel aus dem wirklichen Leben zeigt, wie Messung der Größe von Bremskörpern die Dateninterpretation verzerren kann, da dieses Xenograft den größten Teil des lebensfähigen Tumorzellgehalts verloren hat, während es seine große Masse und Form beibehält. Molekulare Detektion durch Echtzeit-PCR kann auch überzeugende Beweise für Gehirnmetastasen im orthotopischen Brustkrebsmodell mit exogener GFP-DNA-Sequenz liefern, da die transfizierte GFP-DNA-Sequenz natürlicherweise nicht bei Menschen oder Nagetieren existiert. Die Implantationsstelle sollte physiologisch und anatomisch mit Krebsmalignität zusammenhängen.
Sowohl Tumorgen als auch Proteinexpression können an primären und distalen Stellen ausgewertet werden und metastasierende Zellen können für eine weitere Charakterisierung isoliert werden.
