Наш протокол преодолевает ограниченное окно биолюминесценции изображения, включая тег GFP, который также облегчает обнаружение и количественную оценку микрометастаса с помощью анализа ПЦР. Поскольку тег GFP обходит ограниченное окно приобретения биолюминесценции, большее количество предметов может быть изображено без потери сигнала, а потенциал ложных отрицательных результатов ограничен. Это исследование будет полезно для исследователей для оценки терапевтической эффективности противоопухохоных средств.
Эта методология обеспечивает полезную модель для исследователей, заинтересованных в ЭМТ, лекарственной устойчивости и механизмов стволовых клеток рака, связанных с метастатическим процессом, а также для разработки противоопухоляных препаратов. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, тампон левой четвертой молочной железы с алкоголем и использовать тонкие крысиные зубные миппы, чтобы поднять четвертую молочную железу немного. Убедившись, что кончик скошен, вставьте 25 калибровочных иглы прилагается к одному миллилитров шприц, содержащий 100 микролитров клеточной мембраны мембраны смеси и слегка втягивать поршень, чтобы убедиться, что игла не контактировать с кровеносными сосудами.
Для сравнительных результатов, место инъекции опухолевых клеток должно быть последовательным среди всех животных-реципиентов. Если кровь не попадает в шприц, медленно ввит весь объем раствора в молочную жировую прокладку. Под кожей появится круглая поднятая масса.
Подождите от 10 до 15 секунд для мембранной матрицы подвала, чтобы затвердеть перед удалением иглы и позволить ксенотрансплантата свободно расти без перерыва в течение семи-десяти дней до выполнения измерения размера опухоли. Затем используйте калиперы для измерения размера ксенотрансплантата у всех мышей и определения объема опухоли с помощью уравнения, как указано. Перед визуализацией животных исследования, изображение трех дополнительных опухолевых подшипников мышей в течение 40 минут с двухминутными интервалами, используя параметры, как указано для получения кинетики люциферина для исследования.
Используйте пиковый измеренный сигнал биолюминесценции для определения оптимального времени получения изображения для всех последующих точек времени. Для выполнения метастазирования изображения, покрыть первичную опухоль с рукавом вырезать из черной перчатки и место анестезированной мыши в сканер, то изображение люциферина сигнала, используя те же параметры, как только что продемонстрировали с брюшной стороны мыши перед камерой для изображения метастазов легких и спинной стороне мыши перед камерой для визуализации метастазов мозга. Используя программное обеспечение для сканирования и анализа данных, нарисуйте область интереса к изображенной области, чтобы обеспечить, чтобы весь орган, представляющий интерес, был охвачен, чтобы дать оценку метастатического бремени и количественно оценить выход биолюминесценции как общий поток и фотоны в секунду.
Сразу же после биолюминесценции сигнала количественно, урожай мозга и легочной ткани и быстро промыть органы в PBS, чтобы удалить любые поверхностные пятна крови. Поместите органы на низкую автоматическую флуоресценцию черной пластиковой пластины и транспортируют образцы в многоспектральный сканер флуоресценции, оснащенный спектральной возможностью немиксирования для обнаружения GFP. Для получения многоспектральных изображений GFP извлеченных органов сканируйте органы от 500 до 720 нанометров с размером шага 10 нанометров.
Для получения ткани авто флуоресценции профиля, сканирование подакцизных органов необъективных контрольных мышей. Кроме того, изображение GFP положительные ткани, такие как первичная опухоль для приобретения автоматической флуоресценции смешанного профиля GFP. Обработать эти спектры в соответствии с протоколом производителя, чтобы создать спектральную библиотеку с чистыми GFP и автоматическими профилями флуоресценции.
После подтверждения точности спектральной библиотеки и отделения сигнала GFP от фона флуоресценции тканей используйте ту же библиотеку, чтобы размесить все изображения при изучении. Для извлечения ДНК после замораживания оснастки поместите весь мозг в пятими миллилитровую гомогенизирующую трубку, содержащую два миллилитров буфера лиза ДНК, и используйте гомогенизатор, установленный на 50, чтобы гомогенизировать ткань. Когда ткань была полностью однородной, передать один миллилитр лизата в DNAse и RNAse бесплатно два миллилитров микроцентрифуга трубки и изолировать ДНК в соответствии с протоколом производителя.
Добавьте 500 микролитров 100% этанола в изолят и смешайте образец инверсией. После трех минут при комнатной температуре используйте пипетку для переноса шерстяного ДНК в новую двухмиллилитровую трубку DNAse и RNAse. Пусть образец воздуха высохнуть в течение одной минуты, прежде чем добавить один миллилитр 75% этанола в трубку и инвертирования трубки три-шесть раз, чтобы вымыть образец.
Отбросьте этанол после последней инверсии перед мытьем ДНК еще два раза со свежим этанолом на стирку, как только что продемонстрировали. После последней стирки воздух высушит образец в течение 10 секунд, прежде чем растворить ДНК в 52 микролитерах восьмимилолярного гидроксида натрия. Перенесите два микролитра алицита ДНК в спектрофотометрический флакон и количественно оцените концентрацию ДНК в образце, используя соотношение абсорбторов между A260 и 280 в соответствии с формулой.
Отрегулируйте концентрацию ДНК образца до 50 нанограмм на микролитр с дополнительными восемью миллимолярными гидроксидом натрия и спроектировать грунтовую пару, специфичную для экзогенной зеленой последовательности GFP в доме, используя веб-портал с открытым исходным кодом для обнаружения ПЦР в режиме реального времени тега GFP и метастатических клеток, которые вторглись и колонизировали дистальные участки опухоли. Затем используйте быстрый реагент ПЦР в режиме реального времени и ПЦР-машину в режиме реального времени, которая поддерживает быстрый протокол ПЦР в режиме реального времени для количественного анализа ПЦР образца в режиме реального времени. Для обнаружения метастатических раковых клеток молочной железы в легких, используйте рассекая ножницы, чтобы открыть грудную полость и сократить мимо сердца и тимуса подвергать трахеи.
Вставьте 22 калибровочных иглы прилагается к 10 миллилитров шприц, содержащий bouin раствор в трахею и угнетать поршень, пока рухнул легкие опухли примерно с двумя миллилитров раствора. Удалите шприц и иглу после того, как легкие были надуты и передать все легкое в 15 миллилитровую трубку, содержащую свежий раствор Bouin. Аккуратно инвертировать трубку несколько раз, прежде чем оставить ткани, чтобы замочить в течение 24 часов при комнатной температуре.
На следующий день промыть легкое водой и поместить образец в трубку 70% этанола. Затем используйте рассечение микроскопа, чтобы подсчитать количество метастатических белых пятен и узелков на поверхностях легких. Измерение объема опухоли с помощью калипера является устоявшимся методом оценки эффективности лечения.
Для получения сопоставимых сигналов между группами исследования необходимо продать предвизионные исследования кинетики BLI, чтобы определить наилучшие сроки визуализации. Благодаря превосходному соотношению сигнала к фону, все тело in vivo BLI довольно чувствительно в обнаружении низкоуровневых метастазных сигналов по сравнению с подходом GFP. Однако, из-за стабильного характера молекулы GFP, исследователи имеют достаточно времени, чтобы обработать тушу до захвата сигналов GFP от органов-мишеней в двойных исследованиях репортера.
Этот пример реальной жизни демонстрирует, как измерения размера опухоли калипера могут исказить интерпретацию данных, поскольку этот ксенотрансплантат потерял большую часть жизнеспособного содержания опухолевых клеток, сохраняя при этом свою большую массу и форму. Молекулярное обнаружение пЦР в режиме реального времени может также предоставить убедительные доказательства метастазов мозга в ортотопической модели рака молочной железы с использованием экзогенного секвенирования ДНК GFP, поскольку трансфицированная последовательность ДНК GFP, естественно, не существует у людей или грызунов. Место имплантации должно быть физиологически и анатомически связано с злокачественностью рака.
Как ген опухоли, так и экспрессия белка могут быть оценены в первичных и дистальных участках, а метастатические клетки могут быть изолированы для дальнейшей характеристики.
