Protokolümüz, pcr analizi ile mikrometastazın saptanmasını ve ölçülmesini kolaylaştıran bir GFP etiketi ekleyerek sınırlı biyolüminesans görüntüleme penceresini aşar. GFP etiketi sınırlı biyolüminesans edinme penceresini aşındırdığından, sinyal kaybı olmadan daha fazla konu görüntülenebilir ve yanlış negatif sonuç potansiyeli sınırlıdır. Bu çalışma, anti-kanser ajanlarının terapötik etkinliğinin değerlendirilmesi için araştırmacılar için yararlı olacaktır.
Bu metodoloji, EMT, ilaç direnci ve metastatik süreç le ilgili kanser kök hücre mekanizmaları nın yanı sıra anti-kanser ilaç gelişimi ile ilgilenen araştırmacılar için yararlı bir model sağlar. Pedal refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, alkol ile sol dördüncü meme bezi bezi bezi ve biraz dördüncü meme bezi kaldırmak için ince sıçan-diş forseps kullanın. Ucun yukarı doğru olduğundan emin olun, hücre bodrum membran matris karışımının 100 mikrolitresini içeren bir mililitreşşile şırıngaya bağlı 25 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve iğnenin herhangi bir kan damarına temas etmediğinden emin olmak için pistonu hafifçe geri çekin.
Karşılaştırmalı sonuçlar için, tümör hücre enjeksiyon sitesi tüm alıcı hayvanlar arasında tutarlı olmalıdır. Şırıngaya kan girmezse, çözeltinin tüm hacmini yavaşça meme yağı yastığına enjekte edin. Bir yuvarlak yükseltilmiş kitle deri altında görünecektir.
İğneyi çıkarmadan önce bazal membran matrisinin sertlemesine 10 ila 15 saniye bekleyin ve tümör boyutu ölçümü yapmadan önce 7 ila 10 gün boyunca ksenogreftin kesintisiz olarak büyümesine izin verin. Daha sonra tüm farelerde ksenogreft boyutunu ölçmek ve belirtildiği gibi denklemi kullanarak tümör hacmini belirlemek için kalipers kullanın. Çalışma hayvanları görüntülemeden önce, çalışma için luciferin kinetik elde etmek için belirtilen parametreleri kullanarak iki dakikalık aralıklarla 40 dakika boyunca görüntü üç ek tümör taşıyan fareler.
Sonraki tüm zaman noktaları için en uygun görüntü edinme süresi penceresini tanımlamak için tepe ölçülen biyolüminesans sinyalini kullanın. Metastaz görüntüleme yapmak için, siyah bir eldivenden kesilmiş bir kol ile birincil tümörü kaplayın ve tarayıcıya anestezili bir fare yerleştirin sonra sadece akciğer metastaz görüntüleme için kamera bakan farenin ventral tarafı ve beyin metastaz görüntüleme için kamera bakan farenin dorsal tarafı ile gösterildiği aynı parametreleri kullanarak luciferin sinyali görüntü. Bir tarayıcı ve veri analizi yazılımı kullanarak, metastatik yükün değerlendirilmesine olanak sağlamak ve biyolüminesans çıktısını saniyede toplam akı ve foton olarak ölçmek için tüm ilgi organının kapsandığından emin olmak için görüntülenmiş alanın üzerine bir ilgi alanı çizin.
Biyolüminesans sinyal idrarından hemen sonra, beyin ve akciğer dokusunu hasat ve herhangi bir yüzeysel kan lekeleri kaldırmak için pbs organları hızlı bir şekilde durulayın. Organları düşük otomatik floresan siyah plastik plakaya yerleştirin ve örnekleri GFP algılaması için spektral karıştırma yeteneği yle donatılmış çok spektral floresan tarayıcıya taşıyın. Çıkarılan organların çok spektral GFP görüntülerini elde etmek için, 10 nanometre adım boyutu ile 500 ila 720 nanometre organları tarayın.
Doku oto floresan profili elde etmek için, enjekte edilmemiş kontrol farelerin excised organları taz. Ayrıca, görüntü GFP pozitif dokular primer tümör gibi otomatik floresan karışık GFP profili elde etmek. Saf GFP ve otomatik floresan profilleri ile bir spektral kütüphane kurmak için üreticinin protokolü uyarınca bu spektrumları işleyin.
Spektral kütüphanenin doğruluğunu doğruladıktan ve GFP sinyalini doku oto floresan arka planından ayırdıktan sonra, çalışmadaki tüm görüntüleri karıştırmak için aynı kütüphaneyi kullanır. Ani donma sonrası DNA ekstraksiyonu için, tüm beyni iki mililitre DNA lizis tamponu içeren beş mililitrelik homojenize bir tüpe yerleştirin ve dokuyu homojenize etmek için 50'ye ayarlanmış bir homogenizer kullanın. Doku tamamen homojenhale geldiğinde, bir mililitre lysat'ı bir DNAse ve RNAse serbest iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve DNA'yı üreticinin protokolüne göre izole edin.
İzole etmek için 500 mikrolitre %100 etanol ekleyin ve ters çevrilerek numuneyi karıştırın. Oda sıcaklığında üç dakika sonra, yeni bir iki mililitre DNaAse ve RNaE serbest tüp için yün benzeri DNA çökelti aktarmak için bir pipet kullanın. Tüpe bir mililitre %75 etanol eklemeden ve numuneyi yıkamak için tüpü üç ila altı kez ters çevirmeden önce numunenin havasını bir dakika kurutun.
Sadece gösterildiği gibi yıkama başına taze etanol ile DNA iki kez daha yıkamadan önce son inversiyon sonra etanol atın. Son yıkamadan sonra, hava sekiz milimolar sodyum hidroksit 52 mikrolitre DNA eritmeden önce 10 saniye boyunca örnek kuru. İki mikrolitrelik DNA aliquot'u bir spektrofotometre şişesine aktarın ve formüle göre A260 ile 280 arasında bir emme oranı kullanarak örnekteki DNA konsantrasyonu ölçün.
Ek sekiz milimolar sodyum hidroksit ile mikrolitre başına 50 nanogram için numunenin DNA konsantrasyonu ayarlayın ve gfp etiketi nin gerçek zamanlı PCR tespiti için açık kaynak primer tasarım web portalı ve tümörün distal siteleri kolonize olan metastatik hücreleri kullanarak ek olarak yeşil GFP dizisine özgü astar çiftini şirket içinde tasarlayın. Ardından, numunenin gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi için hızlı gerçek zamanlı PCR protokolünü destekleyen gerçek zamanlı bir PCR reaktifi ve gerçek zamanlı BIR PCR makinesi kullanın. Akciğerde metastatik meme kanseri hücrelerinin tespiti için, göğüs boşluğu açmak için makas diseksiyon kullanın ve trakea ortaya çıkarmak için kalp ve timus geçmiş kesti.
Trakea içine Bouin çözeltisi içeren 10 mililitrelik şırınga bağlı bir 22 gauge iğne takın ve çökmüş akciğerler çözeltinin yaklaşık iki mililitre ile şişmiş olana kadar piston depress. Akciğerler şişirildikten sonra şırınga ve iğneyi çıkarın ve tüm akciğeri taze Bouin solüsyonu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yavaşça oda sıcaklığında 24 saat bekletmek için doku bırakmadan önce tüp birkaç kez ters.
Ertesi gün, su ile akciğer durulayın ve% 70 etanol bir tüp içine örnek yerleştirin. Sonra akciğerlerin yüzeylerinde metastatik beyaz lekeler ve nodüllerin sayısını saymak için bir diseksiyon mikroskop kullanın. Kaliper ile tümör hacim ölçümü tedavi etkinliğini değerlendirmek için köklü bir yöntemdir.
Çalışma grupları arasında karşılaştırılabilir sinyaller elde etmek için, en iyi görüntüleme zaman dilimini belirlemek için bir ön görüntüleme BLI kinetik çalışması yapılmalıdır. Üstün sinyal-arka plan oranı nedeniyle, vivo BLI tüm vücut GFP yaklaşımına göre düşük seviyeli metastaz sinyalleri tespit oldukça hassastır. Ancak, GFP molekülünün istikrarlı doğası nedeniyle, araştırmacılar çift muhabir çalışmalarda hedef organlardan GFP sinyalleri yakalamadan önce karkas işlemek için yeterli zamana sahip.
Bu gerçek yaşam örneği kaliper tümör boyutu ölçümleri hala büyük kütle ve şekil korurken bu ksenogreft canlı tümör hücre içeriğinin çoğunu kaybetti gibi veri yorumunu bozabilir nasıl göstermektedir. Gerçek zamanlı PCR ile moleküler algılama da transfected GFP DNA dizisi doğal olarak insanlar da veya kemirgenler mevcut değildir gibi eksojen GFP DNA dizilimi kullanarak ortopik meme kanseri modelinde beyin metastazı ikna edici kanıt sağlayabilir. İmplantasyon bölgesi fizyolojik ve anatomik olarak kanser malignitesi ile ilgili olmalıdır.
Hem tümör geni hem de protein ekspresyonu primer ve distal bölgelerde değerlendirilebilir ve metastatik hücreler daha fazla karakterizasyon için izole edilebilir.
