המחברים מבקשים להודות מימון הניתן על ידי התכנית להקצאת משאבי קליפורניה בסן פרנסיסקו.

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה תחת בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. 1. עכבר עוברי דמעות בלוטות (LG): קצירה וMicrodissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נהלים שאושרו על ידי בעלי חיים המוסדיים לועדת אתיקה המדעית מחקר, להרדים מתוזמן נשים CD-1 (או מהונדס) בהריון עם משאיפת CO 2 עולה, ואחריו אישור על ידי נקע בצוואר הרחם לעוברי קציר ביום העוברי המתאים. לייעד את היום של E0 גילוי תוסף נרתיק. הערה: בלוטות דמע (LGS) ניתן לקצור מבמת הניצן אחת E14 ואילך. עם זאת, E16 - עוברים (5 10 ניצנים) לתת תוצאות עקביות ביותר לתרבות ex vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את vצד entral של העכבר באמצעות אתנול 70%. לצבוט את העור ועושה חתך בקו האמצע עם מספריים כירורגיות סטרילי; לחתוך את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. הסר את קרן הרחם 2 על ידי חיתוך לאורך mesometrium בחלק העליון של כל קרן רחם ומקום בקור PBS (בופר פוספט) או תקשורת F12 DMEM בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים (# 5), להסיר עוברים מהצ&#39;קים מי השפיר ומקום לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה שנייה PBS הקר. היזהר שלא לגעת בעיניים או באזור הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובר על מיקרוסקופ לנתח עם בסיס שקוף. אם העובר הוא &lt;E17, לבצע שלבי 1.5-1.7. אם הם עובר&gt; E17, השלבים הבאים עשויים להיות מועילים, אך אינם חיוניים, ולכן המשיכו לשלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הראש מהגוף, ממש מתחת ללסת התחתונה התחתונה (השלב ​​1, איור 2) usinאזמל סטרילי ga (# 10 להב). לסובב את הראש כדי שהלסת התחתונה היא עכשיו על הצלחת לנתח. שימוש במלקחיים כדי לייצב את הראש ואזמל כדי להסיר כ ¼ מהצד הגב של מוח (שלב 2, 1 חתך st, איור 2) - זה חשוב במיוחד ברגע שהסחוס מתקשח סביב E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הראש כך שהאזמל יכול לחדור את האף בין העיניים. ביצוע חתך דרך מרכז הראש, כך שהעיניים נמצאות כעת בחצי נפרדים (שלב 2, 2 חתך nd, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני # 5 מלקחיים, לקחת מחצית מהראש ולהסיר רקמה עודפת (ראה שלב 3, איור 2). הקפד לכוון את הראש כל כך LG (הממוקם בפינה האחורית התחתונה של העין) הוא לא איבד בתהליך ההסרה זה. הסר מוחי עודפים, סחוס, ורקמות האף מסביב ומתחת לעין. מאז הבלוטה היא בקושי נראית בשלב זה, להבטיח את העין בכיוון נכון לאחר t הסרת רקמה עודפתo להימנע מאיבוד המיקום של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס בזהירות את העור מאחורי, בפינה תחתונה של העין עם שני המלקחיים. הסר את העור על ידי משיכת פתוחה בזהירות עם המלקחיים כדי לחשוף את LG. השתמש בתאורה נוספת מעל ומתחת לרקמה כדי לעזור להמחיש את LG. הערה: LG, להבחין במראה שלה כמו ניצן בצינור בתוך mesenchyme כהה יותר, תמצית, צריך להיות גלוי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתחיל בזהירות לנתח את LG וmesenchyme קשור (ראה לשרטט ותמונות) מהרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים, נזהר שלא לתפוס את LG או הצינור הקשורים אליו. ברגע שהבלוטה היא חופשית מהרקמה הסובבת, בעדינות להסיר את כל הבלוטה על ידי אחיזת האפיטל המקיף את העין בבסיס צינור LG. דואג לשמר את mesenchyme מקיף את האפיתל, אשר ניתן לצפות כmesenchyme תמצית לתוכו invaginates האפיתל. הערה: חלק ההסרה נוספת של tissuדואר (כל שברי עצמות קטנים, שרירים, ורקמות חיבור) עשויים להיות נחוצים כדי להימנע מאיתות גורמים / צמיחה לשכנתה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות, קציר 4 - 5 בלוטות וmesenchyme קשורים לכל צלחת (LGS צופה מייד עם נתיחה); לאסוף מינימום של 14 בלוטות לשל חיץ תמוגה RNA לRT-PCR 6 100 μl. </li></ol> 2. להכין צלחות לאקס תרבות Vivo הליך זה מבוסס על שהעסיק לבלוטות רוק פיתוח 7,8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של F12 DMEM (בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) תקשורת ותרבות עם 50 מיקרוגרם / חומצה אסקורבית מיליליטר ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר הולוגרמות transferrin לצלחת microwell קוטר 50 מ&quot;מ עם רצפת זכוכית 7. הערה: F12 DMEM נבחר כפי שמצאנו אותו בעבר על מנת למקסם את המורפוגנזה בבלוטת הרוק העוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצוף polycarb 13 מ&quot;ממסנן קרום Onate עם 0.1 מיקרומטר נקבוביות על גבי מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לדלל laminin 3-D 1: 1 עם DMEM / F12 כדי להפוך את הריכוז סופי של 3 מ&quot;ג / מיליליטר (200 להשתמש פיפטה μl לערבב בעדינות; צנטריפוגות 1 דקות אם מופיעות בועות). הוסף 15 μl זה מדולל laminin 3-D כדי לסנן. הערה: דילול זו נמצא להיות אופטימלי לשמירת LG במצב 3D שלה מבלי להתפשר על הסתעפות אפיתל. עם זאת, זה לא חיוני לתרבות של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 4 - 5 LG על מסנן או לlaminin. תרבות LGS vivo לשעבר ל24-48 שעות (איור 3) או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לניתוח נוסף על ידי qPCR או immunostaining (איור 4). לניתוח qPCR של רקמת בלוטות עוברית, עיין באל Rebustini et., 2011. לניתוח immunofluorescent של רקמות בלוטות עוברי עיינו בציטוטים הבאים: et al הופמן, (2002) ו- e שטיינברג.t אל., (2005). </li></ol> 3. עכבר אחרי לידה ומבוגרי דמעות בלוטות (LG): Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר לאחר הלידה על פי הסטנדרטים של ועדת אתיקה של בעלי החיים המתאימה. לגורים לאחר לידה יום 8 או צעירים יותר, להרדים על ידי ניתוק הראש עם מספריים סטריליים. ליום לידה 8 ומעלה, לרסס פרווה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתר את LG, להניח את העכבר לרוחב צד כלפי מעלה, תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. הערה: LG לאחר הלידה והמבוגרת גובל בעורק הראשי, השריר המלעס והדרמיס (ראה תרשים 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קטנים, לעשות חתך קטן בעור רוחבי משם צריך להיות ממוקם LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למשוך לפתוח את האפידרמיס לכיוון האוזן כדי לחשוף את LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לשחרר בעדינות LG מרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא שוחרר מבית LG רקמה הסובב, להסיר את LG בקפידה על ידי הצינור,על ידי אחיזה בי הצינור והאפיטל המקיף את העין להתחבר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח LGS במאגר תמוגה RNA לRT-PCR, או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לimmunostaining. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

צדדיות לתרבות ולתפעל את LG vivo לשעבר מספק יתרונות משמעותיים ללימוד הפיתוח שלה. זה כולל את המהירות שבה החוקר הוא מסוגל לבחון השערות והריבוי של הפרעות שניתן לבצע כדי להעריך עד כמה אפיתל, עצבי, אנדותל ותאי mesencyhmal אינטראקציה ליצירת האיברים. עם זאת, ישנם מספר סייגים כאש?...

בלוטת הדמעות (LG) היא אחראית להפרשת דמעות מימית קריטית לחדות ראייה והבריאות, תחזוקה, והגנה על התאים של פני השטח העין. תוצאות תפקוד לקוי של LG באחת מההפרעות עיניות הנפוצות והמתישות ביותר: יבשים חסר מימית מחלות עיניים, אשר מאופיינת על ידי גירוי עיני, רגישות לאור וירידה בראייה 1. באדם LG מתגורר במסלול מעל הקצה הלטרלי של העין שבו 3 - 5 דמעות הפקדת צינוריות הפרשה על פני השטח של העין. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת הדמעות הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן (exorbital) עם דמעות בנסיעות לעין באמצעות צינור הפרשה אחד. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור למ &#39;רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה (איור 1) 2. במהלך פיתוח האפיתל הופך כלי דם, כמו גם בכבדות innervated על ידי העצבים הפאראסימפתטית של גנגליון pterygopalatine ומידה פחותה יותר על ידי עצבים סימפטיים מצוואר רחם הגנגליון מעולה 3. יחסי גומלין בין כל אחד מהתאים האלה סוגים כלומר תאים עצביים, אפיתל, אנדותל וmesenchymal, חיוניים לתפקוד ולתחזוקה של הרקמות בוגרות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס תיאום פיתוח LG והתחדשות כמו גם איך תקשורת בין-סוג התא מנחה תהליכים אלה עדיין לא ברורים. כניסתו של עוברי לשעבר טכניקות תרבות vivo אפשרה זיהוי של מסלולים התפתחותיים ומשובים באיברי הסתעפות מרובים 4. Culturing ex vivo נותן החוקר היכולת לתפעל את האיבר (chanical, גנטי או כימי) בתנאים מוגדרים, כמו גם לאפיין אינטראקציות התפתחות איברים ותאי תאים בזמן אמת. LG exorbital של העכבר הוא נוח מאוד בטכניקה זו ומחקרים שנעשו לאחרונה הוגדרו מערכות אזעקה המווסתות את התפתחותה 2,5. עם זאת, על אף הצורך להבין רמזים מולקולריים שבבסיס התפתחות LG והתחדשות, זה כרגע נשאר understudied, ככל הנראה בשל הקשיים הטכניים בבידוד האיברים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולבצע תרבות vivo לשעבר של LG העכברי העוברי להגדיר תוכניות התפתחותיות.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

בלוטת הדמעות (LG) מפרישה דמעות מימיות הכרחיות לשמירה על המבנה והתפקוד של הקרנית, רקמה שקופה חיונית לראייה. באדם LG יחיד מתגורר במסלול מעל הקצה לרוחב של כל עין ומספקת דמעות על פני השטח של העין באמצעות 3 - 5 צינורות. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת דמעות exorbital הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור כדי ליצור רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה. תהליך מורכב זה תועד היטב באיברים רבים אפיתל אחרים כגון הלבלב ובלוטות רוק. עם זאת, LG היה הרבה פחות חקר ומנגנוני השליטה המורפוגנזה הם גרוע תחתעמד. אנו חושדים כי תת-ייצוג זה כמערכת מודל הוא תוצאה של הקשיים הקשורים במציאה, לנתח וculturing LG. לכן, כאן אנו מתארים טכניקות לנתיחה לעובריים קציר ולאחר הלידה LG ושיטות לתרבות vivo לשעבר של הרקמה.

<html> LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל. תמונות Brightfield של LGS העוברי גזור בE14, E15, E16, E17, וP2 להמחיש את האירוע הזה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. LG מתפתח בתהליך של א...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  University of California San Francisco.  בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

מודל ארנב של מחלה מימית לקויה עין יבש הנגרמת על ידי Concanavalin זריקה לתוך בלוטות לקטמאל: יישום ללימודי יעילות הסמים

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Medicine

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

הקמת מודל העין יבש קשה באמצעות השלמת דקרייוקטומיה בארנבונים

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות הנגרמת על ידי סקופולמין בחולדות

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

מחבר זרקור: אתגרים בפיתוח מודלים של בעלי חיים בעין יבשה וכיווני מחקר עתידיים

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

הסרת בלוטת הדמעות העליונה: טכניקה כירורגית להסרת החלקים המישושיים והמסלוליים של בלוטת הדמעות העליונה ממודל ארנב

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודל ארנב של מחלה מימית לקויה עין יבש הנגרמת על ידי Concanavalin זריקה לתוך בלוטות לקטמאל: יישום ללימודי יעילות הסמים

הקמת מודל העין יבש קשה באמצעות השלמת דקרייוקטומיה בארנבונים

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

הסרת בלוטת הדמעות העליונה: טכניקה כירורגית להסרת החלקים המישושיים והמסלוליים של בלוטת הדמעות העליונה ממודל ארנב