המחברים מבקשים להודות מימון הניתן על ידי התכנית להקצאת משאבי קליפורניה בסן פרנסיסקו.

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה תחת בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. 1. עכבר עוברי דמעות בלוטות (LG): קצירה וMicrodissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נהלים שאושרו על ידי בעלי חיים המוסדיים לועדת אתיקה המדעית מחקר, להרדים מתוזמן נשים CD-1 (או מהונדס) בהריון עם משאיפת CO 2 עולה, ואחריו אישור על ידי נקע בצוואר הרחם לעוברי קציר ביום העוברי המתאים. לייעד את היום של E0 גילוי תוסף נרתיק. הערה: בלוטות דמע (LGS) ניתן לקצור מבמת הניצן אחת E14 ואילך. עם זאת, E16 - עוברים (5 10 ניצנים) לתת תוצאות עקביות ביותר לתרבות ex vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את vצד entral של העכבר באמצעות אתנול 70%. לצבוט את העור ועושה חתך בקו האמצע עם מספריים כירורגיות סטרילי; לחתוך את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. הסר את קרן הרחם 2 על ידי חיתוך לאורך mesometrium בחלק העליון של כל קרן רחם ומקום בקור PBS (בופר פוספט) או תקשורת F12 DMEM בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים (# 5), להסיר עוברים מהצ&#39;קים מי השפיר ומקום לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה שנייה PBS הקר. היזהר שלא לגעת בעיניים או באזור הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובר על מיקרוסקופ לנתח עם בסיס שקוף. אם העובר הוא &lt;E17, לבצע שלבי 1.5-1.7. אם הם עובר&gt; E17, השלבים הבאים עשויים להיות מועילים, אך אינם חיוניים, ולכן המשיכו לשלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הראש מהגוף, ממש מתחת ללסת התחתונה התחתונה (השלב ​​1, איור 2) usinאזמל סטרילי ga (# 10 להב). לסובב את הראש כדי שהלסת התחתונה היא עכשיו על הצלחת לנתח. שימוש במלקחיים כדי לייצב את הראש ואזמל כדי להסיר כ ¼ מהצד הגב של מוח (שלב 2, 1 חתך st, איור 2) - זה חשוב במיוחד ברגע שהסחוס מתקשח סביב E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הראש כך שהאזמל יכול לחדור את האף בין העיניים. ביצוע חתך דרך מרכז הראש, כך שהעיניים נמצאות כעת בחצי נפרדים (שלב 2, 2 חתך nd, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני # 5 מלקחיים, לקחת מחצית מהראש ולהסיר רקמה עודפת (ראה שלב 3, איור 2). הקפד לכוון את הראש כל כך LG (הממוקם בפינה האחורית התחתונה של העין) הוא לא איבד בתהליך ההסרה זה. הסר מוחי עודפים, סחוס, ורקמות האף מסביב ומתחת לעין. מאז הבלוטה היא בקושי נראית בשלב זה, להבטיח את העין בכיוון נכון לאחר t הסרת רקמה עודפתo להימנע מאיבוד המיקום של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס בזהירות את העור מאחורי, בפינה תחתונה של העין עם שני המלקחיים. הסר את העור על ידי משיכת פתוחה בזהירות עם המלקחיים כדי לחשוף את LG. השתמש בתאורה נוספת מעל ומתחת לרקמה כדי לעזור להמחיש את LG. הערה: LG, להבחין במראה שלה כמו ניצן בצינור בתוך mesenchyme כהה יותר, תמצית, צריך להיות גלוי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתחיל בזהירות לנתח את LG וmesenchyme קשור (ראה לשרטט ותמונות) מהרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים, נזהר שלא לתפוס את LG או הצינור הקשורים אליו. ברגע שהבלוטה היא חופשית מהרקמה הסובבת, בעדינות להסיר את כל הבלוטה על ידי אחיזת האפיטל המקיף את העין בבסיס צינור LG. דואג לשמר את mesenchyme מקיף את האפיתל, אשר ניתן לצפות כmesenchyme תמצית לתוכו invaginates האפיתל. הערה: חלק ההסרה נוספת של tissuדואר (כל שברי עצמות קטנים, שרירים, ורקמות חיבור) עשויים להיות נחוצים כדי להימנע מאיתות גורמים / צמיחה לשכנתה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות, קציר 4 - 5 בלוטות וmesenchyme קשורים לכל צלחת (LGS צופה מייד עם נתיחה); לאסוף מינימום של 14 בלוטות לשל חיץ תמוגה RNA לRT-PCR 6 100 μl. </li></ol> 2. להכין צלחות לאקס תרבות Vivo הליך זה מבוסס על שהעסיק לבלוטות רוק פיתוח 7,8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של F12 DMEM (בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) תקשורת ותרבות עם 50 מיקרוגרם / חומצה אסקורבית מיליליטר ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר הולוגרמות transferrin לצלחת microwell קוטר 50 מ&quot;מ עם רצפת זכוכית 7. הערה: F12 DMEM נבחר כפי שמצאנו אותו בעבר על מנת למקסם את המורפוגנזה בבלוטת הרוק העוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצוף polycarb 13 מ&quot;ממסנן קרום Onate עם 0.1 מיקרומטר נקבוביות על גבי מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לדלל laminin 3-D 1: 1 עם DMEM / F12 כדי להפוך את הריכוז סופי של 3 מ&quot;ג / מיליליטר (200 להשתמש פיפטה μl לערבב בעדינות; צנטריפוגות 1 דקות אם מופיעות בועות). הוסף 15 μl זה מדולל laminin 3-D כדי לסנן. הערה: דילול זו נמצא להיות אופטימלי לשמירת LG במצב 3D שלה מבלי להתפשר על הסתעפות אפיתל. עם זאת, זה לא חיוני לתרבות של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 4 - 5 LG על מסנן או לlaminin. תרבות LGS vivo לשעבר ל24-48 שעות (איור 3) או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לניתוח נוסף על ידי qPCR או immunostaining (איור 4). לניתוח qPCR של רקמת בלוטות עוברית, עיין באל Rebustini et., 2011. לניתוח immunofluorescent של רקמות בלוטות עוברי עיינו בציטוטים הבאים: et al הופמן, (2002) ו- e שטיינברג.t אל., (2005). </li></ol> 3. עכבר אחרי לידה ומבוגרי דמעות בלוטות (LG): Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר לאחר הלידה על פי הסטנדרטים של ועדת אתיקה של בעלי החיים המתאימה. לגורים לאחר לידה יום 8 או צעירים יותר, להרדים על ידי ניתוק הראש עם מספריים סטריליים. ליום לידה 8 ומעלה, לרסס פרווה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתר את LG, להניח את העכבר לרוחב צד כלפי מעלה, תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. הערה: LG לאחר הלידה והמבוגרת גובל בעורק הראשי, השריר המלעס והדרמיס (ראה תרשים 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קטנים, לעשות חתך קטן בעור רוחבי משם צריך להיות ממוקם LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למשוך לפתוח את האפידרמיס לכיוון האוזן כדי לחשוף את LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לשחרר בעדינות LG מרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא שוחרר מבית LG רקמה הסובב, להסיר את LG בקפידה על ידי הצינור,על ידי אחיזה בי הצינור והאפיטל המקיף את העין להתחבר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח LGS במאגר תמוגה RNA לRT-PCR, או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לimmunostaining. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

צדדיות לתרבות ולתפעל את LG vivo לשעבר מספק יתרונות משמעותיים ללימוד הפיתוח שלה. זה כולל את המהירות שבה החוקר הוא מסוגל לבחון השערות והריבוי של הפרעות שניתן לבצע כדי להעריך עד כמה אפיתל, עצבי, אנדותל ותאי mesencyhmal אינטראקציה ליצירת האיברים. עם זאת, ישנם מספר סייגים כאש?...

בלוטת הדמעות (LG) היא אחראית להפרשת דמעות מימית קריטית לחדות ראייה והבריאות, תחזוקה, והגנה על התאים של פני השטח העין. תוצאות תפקוד לקוי של LG באחת מההפרעות עיניות הנפוצות והמתישות ביותר: יבשים חסר מימית מחלות עיניים, אשר מאופיינת על ידי גירוי עיני, רגישות לאור וירידה בראייה 1. באדם LG מתגורר במסלול מעל הקצה הלטרלי של העין שבו 3 - 5 דמעות הפקדת צינוריות הפרשה על פני השטח של העין. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת הדמעות הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן (exorbital) עם דמעות בנסיעות לעין באמצעות צינור הפרשה אחד. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור למ &#39;רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה (איור 1) 2. במהלך פיתוח האפיתל הופך כלי דם, כמו גם בכבדות innervated על ידי העצבים הפאראסימפתטית של גנגליון pterygopalatine ומידה פחותה יותר על ידי עצבים סימפטיים מצוואר רחם הגנגליון מעולה 3. יחסי גומלין בין כל אחד מהתאים האלה סוגים כלומר תאים עצביים, אפיתל, אנדותל וmesenchymal, חיוניים לתפקוד ולתחזוקה של הרקמות בוגרות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס תיאום פיתוח LG והתחדשות כמו גם איך תקשורת בין-סוג התא מנחה תהליכים אלה עדיין לא ברורים. כניסתו של עוברי לשעבר טכניקות תרבות vivo אפשרה זיהוי של מסלולים התפתחותיים ומשובים באיברי הסתעפות מרובים 4. Culturing ex vivo נותן החוקר היכולת לתפעל את האיבר (chanical, גנטי או כימי) בתנאים מוגדרים, כמו גם לאפיין אינטראקציות התפתחות איברים ותאי תאים בזמן אמת. LG exorbital של העכבר הוא נוח מאוד בטכניקה זו ומחקרים שנעשו לאחרונה הוגדרו מערכות אזעקה המווסתות את התפתחותה 2,5. עם זאת, על אף הצורך להבין רמזים מולקולריים שבבסיס התפתחות LG והתחדשות, זה כרגע נשאר understudied, ככל הנראה בשל הקשיים הטכניים בבידוד האיברים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולבצע תרבות vivo לשעבר של LG העכברי העוברי להגדיר תוכניות התפתחותיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

בלוטת הדמעות (LG) מפרישה דמעות מימיות הכרחיות לשמירה על המבנה והתפקוד של הקרנית, רקמה שקופה חיונית לראייה. באדם LG יחיד מתגורר במסלול מעל הקצה לרוחב של כל עין ומספקת דמעות על פני השטח של העין באמצעות 3 - 5 צינורות. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת דמעות exorbital הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור כדי ליצור רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה. תהליך מורכב זה תועד היטב באיברים רבים אפיתל אחרים כגון הלבלב ובלוטות רוק. עם זאת, LG היה הרבה פחות חקר ומנגנוני השליטה המורפוגנזה הם גרוע תחתעמד. אנו חושדים כי תת-ייצוג זה כמערכת מודל הוא תוצאה של הקשיים הקשורים במציאה, לנתח וculturing LG. לכן, כאן אנו מתארים טכניקות לנתיחה לעובריים קציר ולאחר הלידה LG ושיטות לתרבות vivo לשעבר של הרקמה.

<html> LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל. תמונות Brightfield של LGS העוברי גזור בE14, E15, E16, E17, וP2 להמחיש את האירוע הזה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. LG מתפתח בתהליך של א...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  University of California San Francisco.  בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

בעזרת פינצטה לייזר עבור מניפולציה נוירונים מבודד במבחנה

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murine נוהל השתלת כליה

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

טכניקות ביופסיה בלוטת חלב שור

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...